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建议培养操作步骤（仅供参考）

1. 细胞复苏： 1) 将冻存管从液氮中取出，快速放入37°C水浴锅中，轻摇冻存管使之溶解； 2) 溶解后把细胞悬液转移到含有5ml培养基的离心管中，离心收集细胞，室温1000rpm 离心3 min， 弃上清； 3) 加入新鲜的完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液接种到含6-8ml完全培养基的培养瓶中轻轻吹打混 匀，37°C、5% CO2饱和湿度条件下培养过夜。 天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2. 细胞传代（以T25瓶为例）：

 贴壁细胞 （一）细胞汇合度达80%-90%，即可进行传代培养。对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：1) 吸出原培养液； 2) 加入3ml左右不含钙、镁离子的PBS，轻轻晃动培养瓶润洗细胞,吸出PBS丢弃； 3) 加入1ml左右0.25%胰蛋白酶溶液（含EDTA），轻轻晃动培养瓶使之浸润所有细胞； 4) 置于37°C培养箱消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），显微镜下看到细胞明显变 圆，有间隙时可终止，全程不要拍打培养瓶； 5) 加入3ml含10%胎牛血清的培养基终止消化，轻轻吹打混匀后吸出，细胞尽量呈单细胞悬液； 6) 将细胞悬液转移至离心管中，室温1000rpm离心3分钟，弃去上清液 ； 7) 加入2ml新鲜培养基，吹打几下混匀细胞即可。 传代将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中， 添加6-8ml新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:3~1:4的比例进行。

悬浮细胞 （二）悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。一般情况下细胞密度维持在 1×10^5~1×10^6个/mL（不同细胞对密度要求不同）, 传代将细胞悬液按1：2的比例分到新T25 瓶中，添加6-8ml新鲜的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:4的比例进 行。

 3. 细胞冻存： 1) 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例； 2) 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中1000rpm离心3-5min，弃去上清； 3) 加入细胞冻存液（30% 基础培养基+60%FBS+10%DMSO）重悬细胞，可使用血球计数板计数，来 决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml，将悬液加入到冻存管 中； 4) 将冻存管放入梯度冻存盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中长期保存。

注意事项

本司产品仅用于科研,不用于临床诊断;在线咨询联系销售技术支持。

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