文献分享：多重免疫荧光联合原位杂交解析动物组织免疫病理学

一、研究背景

组织作为构成器官、器官系统及有机体协同生物学功能的关键网络，其原位状态的解析对于理解和调控影响动物健康的生物学结果至关重要。然而，在动物医学领域，原位研究长期受限于物种兼容免疫试剂的匮乏——针对目标细胞、功能或病理标志物的免疫试剂可获得性极低，即便找到相关试剂，也往往仅能实现单个或少数几个标志物的同时检测，难以对组织状态形成全面的生物学解读。

基于这一核心瓶颈，研究 “In situ staining with antibodies cross-reactive in pigs, cattle, and white-tailed deer facilitates understanding of biological tissue status and immunopathology” 开发了多重显色免疫组织化学方案，用于跨物种淋巴结免疫细胞的比较研究，并在猪组织中验证了荧光多重染色检测蛋白共定位信号的能力。鉴于动物中蛋白反应性抗体的稀缺性和制备难度，研究进一步提出通过 RNA 水平设计靶向原位目标的免疫试剂，并与物种抗体染色进行多重组合，以突破原位检测中免疫试剂的限制。为证实 RNA 与蛋白联合检测在阐释组织状态和免疫病理学中的作用，研究在猪扁桃体组织中实现了细胞特异性蛋白标志物与塞内卡病毒 A（SVA）RNA 的联合染色。

二、研究方法

组织样本经10%中性缓冲福尔马林固定约24小时，随后按照常规流程进行脱水、石蜡包埋和切片处理。筛选出针对5类关键标志物的抗体，包括：巨噬细胞/树突状细胞标志物IBA-1、T细胞标志物CD3、B细胞标志物Pax5、增殖细胞标志物Ki-67、上皮细胞标志物细胞角蛋白。之后遵循单染色免疫组化及多重染色免疫组化验证、多重免疫荧光染色验证、显色法 RNA 原位杂交、多重免疫荧光和RNA原位杂交共检测验证的逻辑进行实验。样本处理孵育封片后，荧光染色结果通过尼康 A1R 共聚焦显微镜观察。多重免疫荧光和RNA原位杂交共检测首先采用RNAscope技术进行RNA原位杂交，以SVA衣壳蛋白1基因序列为靶点设计探针；蛋白与RNA共检测基于改良的RNAscope多重荧光检测试剂盒与免疫荧光整合共检测流程，通过Opal 570检测RNA信号，通过TSA 650结合二抗检测蛋白信号。先验证抗体与RNAscope技术的兼容性，再以SVA感染猪的扁桃体组织为样本，实现SVA RNA与细胞标志物蛋白的共检测。

三、结果分析

动物组织中标志物的IHC检测

该图的核心目的是验证筛选出的抗体在猪、牛、鹿三种不同兽医相关物种FFPE组织中的保守反应性。实验选用腭扁桃体组织作为检测样本，通过单一IHC染色展示了CD3、Pax5、IBA-1、gtIBA-1、细胞角蛋白、Ki-67在三种物种组织中的阳性染色信号。所选抗体均可在三种物种的目标细胞中特异性结合并显色。

标志物的多重IHC和荧光检测

图A是三重显色IHC结果，以猪、牛、白尾鹿的气管支气管淋巴结为样本，同步检测CD3、Pax5、IBA-1。结果显示三种物种的淋巴结免疫结构符合预期组织学特征：副皮质区以CD3+ T细胞为主，被膜下、小梁和髓窦以IBA-1+巨噬细胞/DC为主，淋巴滤泡以Pax5+ B细胞为主。该结果证明三重显色IHC可有效用于跨物种淋巴结免疫结构的比较分析。

图B为四重免疫荧光染色结果，以猪肠系膜淋巴结为样本，同步检测IBA-1、CD3、Pax5、Ki-67，并展示了各标志物的单通道灰度图。结果除了验证与图A一致的免疫细胞分布规律外，还实现了共定位信号的清晰检测，可直接识别出同时表达Ki-67的IBA-1+巨噬细胞/DC、Pax5+ B细胞和CD3+ T细胞，表明存在增殖状态的免疫细胞。且多数Ki-67+细胞与Pax5+细胞共定位并集中在淋巴滤泡内，证明存在含增殖B细胞的活性生发中心。

抗体染色与RNA原位杂交的兼容性验证

以猪、牛、白尾鹿的扁桃体组织为样本，通过荧光染色验证了所选抗体与RNAscope RNA原位杂交技术的兼容性。实验同时检测各蛋白标志物与管家基因UBC的RNA，并展示了各标志物的单通道灰度图。在三种物种中，所有测试抗体的蛋白染色信号均可与UBC RNA信号清晰共定位，无明显干扰。证明所选抗体可与RNA原位杂交技术兼容，为后续开发“蛋白-RNA共检测”的多重原位方案提供了关键依据。

蛋白-RNA共检测在免疫病理学研究中的应用

以SVA感染猪的腭扁桃体组织为样本，先通过显色展示SVA特异性RNA在组织中的分布，结果显示病毒RNA主要集中在亚上皮滤泡间实质内及周围区域，明确了病毒在组织中的感染定位区域。之后多重荧光染色同步检测蛋白标志物与SVA RNA，并展示了关键区域的单通道灰度图。实验结果发现，塞内卡病毒 A 的 RNA 信号和目标蛋白信号能够精准定位在同一细胞上。这不仅证明了 “抗体检测 + RNA 原位杂交” 的联合检测方法是可靠有效的，还能清晰地看出这种病毒更倾向于感染哪种细胞。该方法为兽医领域研究传染病的免疫病理机制，提供了一条全新的技术思路。

四、总结

本研究针对兽医领域原位研究中物种兼容免疫试剂匮乏、多重标志物检测困难的核心痛点，通过系统筛选与验证，成功建立了一套可在猪、牛、鹿等多种兽医物种中使用的多重原位染色技术，包括明场多重IHC、荧光多重IHC及蛋白-RNA整合原位检测方案。且所选抗体具有跨物种保守反应性，可精准识别目标细胞标志物，多重染色方法能清晰解析组织免疫景观及细胞功能状态，蛋白与RNA的共检测可有效明确病原体感染的靶细胞类型。这些研究成果不仅解决了传统兽医原位研究中的技术难题，还为不同动物物种之间的组织特征和免疫病理对比研究，提供了标准化的方法工具。同时，也为后续研究兽医传染病的发病原因、筛选疾病诊断标志物等工作，打下了重要的技术基础。

参考文献

Wiarda JE, Zanella EL, Shircliff AL, Cassmann ED, Loving CL, Buckley AC, Palmer MV. In situ staining with antibodies cross-reactive in pigs, cattle, and white-tailed deer facilitates understanding of biological tissue status and immunopathology. Vet Immunol Immunopathol. 2025 Jan;279:110865. doi: 10.1016/j.vetimm.2024.110865. Epub 2024 Dec 12. PMID: 39719720.   

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