文献分享：多重荧光免疫技术揭示结直肠癌生物标志物

一、研究背景与方法

结直肠癌（CRC）是全球范围内发病率和死亡率居高不下的恶性肿瘤，约占全球癌症总发病数的 9.7%、癌症死亡数的 8.5%。尽管目前对结直肠癌的分子发病机制已有新的研究认知，但现有治疗手段仍无法显著提升患者总生存期，相当一部分患者在术后 5 年内会发生局部复发与远处转移，即便多学科综合诊疗取得一定进展，患者的无病生存期依旧不理想。同时，传统基于肿瘤大小、淋巴结及远处转移的 TNM 分期系统与组织学分级的疾病风险分层方式，不足以实现对结直肠癌个体患者的精准预后评估。而现阶段用于诊断的癌胚抗原（CEA）等血清学标志物，虽能检测治疗后疾病复发，却因标志物变化并非在所有患者体内均可检测，存在可靠性不足的问题。因此，临床中迫切需要发掘新的结直肠癌临床病理标志物与预后标志物。针对这一需求，在《Multiplex Immunohistochemistry Indicates Biomarkers in Colorectal Cancer》一文中，作者创新性地运用多重荧光免疫组化技术（mIHC），以84例结直肠癌患者的癌组织及癌旁正常组织为研究对象，构建肿瘤组织芯片（TMA），同步检测癌干细胞标志物CD133、免疫检查点分子PD-L1、肿瘤相关抗原HER2及巨噬细胞标志物CD68的表达水平，结合临床病理特征与7年随访数据，探究上述标志物在结直肠癌中的诊断及预后价值，为结直肠癌的精准诊疗提供了新的技术支撑与理论依据。

研究方法上，研究者采用肿瘤组织芯片，筛选84例具有完整临床及随访资料的结直肠癌患者样本，通过优化mIHC染色条件，运用PANO 7-plex IHC试剂盒对CD133、HER2、PD-L1、CD68进行多重荧光染色，借助Ploaris系统获取多光谱图像，利用InForm图像分析软件进行光谱解混与H-score定量分析，采用Mann-Whitney U检验分析标志物表达差异，Kaplan-Meier法结合log-rank检验分析标志物与患者总生存期（OS）的关联，所有统计分析通过GraphPad Prism 8.0软件完成。

二、核心技术亮点： mIHC

多重荧光免疫组化技术是本次研究的核心技术，相较于传统单标免疫组化技术，其最大优势在于能够在同一张组织切片上，同步检测多种目标蛋白的表达水平，并保留各蛋白在组织内的空间分布关系，有效解决了传统技术“单切片单靶点”的局限性，避免了不同切片间的组织异质性干扰，提升了检测效率与结果准确性。研究者通过构建光谱库、优化抗体浓度与染色顺序，采用TSA荧光标记技术与DAPI核染色结合，实现了CD133、HER2、PD-L1、CD68四种蛋白的清晰标记与精准定量，为后续分析四种标志物的表达关联及临床意义奠定了技术基础，充分体现了mIHC技术在肿瘤多标志物联合检测中的独特价值。

三、研究结果解析

临床病理特征与患者7年总生存期的关联分析

Kaplan-Meier生存曲线聚焦84例结直肠癌患者的7年总生存期（OS），系统分析了T分期、淋巴结转移、远处转移、TNM分期、病理分级及分化程度6项临床病理特征的预后价值。图中橙色虚线代表50%的总生存率，图A为T分期、B为淋巴结转移情况、C为远处转移情况、D为TNM 分期、E和F为病理分级。该图明确了结直肠癌患者的预后与肿瘤进展程度密切相关，为后续分析生物标志物与预后的关联提供了临床基础。

结直肠癌组织的mIHC图谱

聚焦mIHC技术在结直肠癌组织中的染色效果，乙状结肠（图A）和升结肠（图B）两种癌组织的代表性图像，清晰勾勒出单标与多标荧光的分布特征。图中上方及中间小图依次为HE染色、DAPI染色、CD133、PD-L1、HER2、CD68的单标荧光图像，下方大图为四种蛋白与DAPI的多标荧光融合图像。实验观察发现：四种目标蛋白在癌组织中均有不同程度的表达，CD133主要表达于癌细胞表面，PD-L1多表达于癌细胞及免疫细胞表面，HER2主要定位于癌细胞膜，CD68则主要分布于肿瘤微环境中的巨噬细胞。多标融合图像能够清晰区分四种蛋白的空间分布，直观呈现各标志物在同一组织区域的共表达情况，充分验证了mIHC技术能够在单张切片上实现多靶点同步检测的优势，且为后续定量分析提供了可靠的图像依据。

各标志物及其组合的表达差异分析

结合单标标志物表达差异、双标标志物组合表达差异、三标标志物组合表达差异及图标志物与临床病理特征关联的核心数据，围绕CD133、HER2、PD-L1、CD68四种标志物的单标表达、组合表达特征，以及其与临床病理特征的关联，进行综合分析，明确各标志物及组合的临床价值。

从单标标志物表达来看，以H-score为量化指标，CD133、HER2、PD-L1在结直肠癌组织中表达显著高于癌旁正常组织，具有组织特异性，可作为潜在诊断标志物。而CD68在两类组织中表达无显著差异，其作用与肿瘤微环境调控相关。

标志物组合方面，六种双标组合在癌组织中表达均显著高于正常组织，其中CD133与PD-L1、HER2、CD68及PD-L1与CD68的组合差异最显著，提示标志物间存在协同表达关系。而四种三标组合中，仅CD133/HER2/PD-L1与CD133/HER2/CD68表达差异显著，表明以CD133、HER2为核心的组合更具诊断潜力。

标志物与临床病理特征及患者预后的关联分析

与临床病理特征关联显示，HER2在T4a-b期表达高于T1-T3期，可提示肿瘤进展。PD-L1在肿瘤最大径≥5cm者中表达更高，CD133在I-II级病理分级中表达更高，CD68则在III-IV级及有远处转移者中表达更高，印证其在肿瘤微环境及转移中的作用。结合Kaplan-Meier生存曲线分析，四种标志物按H-score分为低、高表达组，结果显示CD133、HER2、PD-L1的高低表达组生存率均无显著差异，仅CD68高表达组生存率显著高于低表达组。综上，CD133、HER2、PD-L1主要与肿瘤临床病理特征相关，可辅助病情评估，而CD68不仅参与肿瘤微环境调控、促进转移，还与患者预后密切相关，高表达CD68提示更好的预后，四种标志物共同为结直肠癌精准诊断、病情评估及预后判断提供多维度参考。

四、总结

这项研究通过mIHC的精准应用，明确了CD133、HER2、PD-L1、CD68四种标志物在结直肠癌组织中的表达特征及临床意义，即CD133和PD-L1可作为结直肠癌早期诊断的潜在生物标志物，HER2可作为判断肿瘤进展程度的指标，CD68不仅与肿瘤转移相关，还可作为预后评估的潜在标志物。该研究充分彰显了mIHC技术在肿瘤多标志物联合检测中的优势，其能够在单张组织切片上实现多靶点的同步检测与空间定位，为肿瘤的精准诊断、预后评估及发病机制研究提供了高效、可靠的技术手段。

此外，该研究也为后续相关研究提供了重要启示，在结直肠癌的临床诊疗中，可借助mIHC技术构建多标志物联合检测体系，提升诊断与预后评估的精准度。同时，CD68在结直肠癌中的双重作用，可促进转移与改善预后，也提示后续需进一步探究肿瘤微环境中巨噬细胞的极化机制，为开发新的免疫治疗靶点提供理论依据。总体而言，这项研究不仅丰富了结直肠癌生物标志物的研究成果，也推动了mIHC技术在临床肿瘤检测中的应用与发展。

参考文献

Zhang W, Song ZJ, Zhang BY, Wang JL, Guo Q, Sun ZW, Tang H. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 2021 Nov;68(6):1272-1282. doi: 10.4149/neo_2021_210312N324. Epub 2021 Aug 30. PMID: 34459208.

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