质粒载体知识点整理

质粒组成要素

一个合格的质粒含有以下组成部分：

l 复制起始位点 Ori ：控制复制起始的位点，原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点，而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点；

l 抗生素抗性基因：便于筛选阳性克隆，如 Amp?（氨苄抗性）、Kan?（卡那霉素抗性）等；

l 多克隆位点 MCS：含有多个限制性酶切位点，用于插入外源基因片段；

l P/E 启动子/增强子：驱动下游基因转录；

l 终止信号：终止转录过程；

l poly(A) 加尾信号：可稳定mRNA，提高翻译效率。

pcDNA3.1(+) 质粒图谱

如何阅读质粒图谱

第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型，判断质粒的宿主范围（原核/真核/穿梭质粒）。

第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。

l Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。

l tetr 可以阻止四环素进入细胞。

l camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。

l neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶 使 G418（长那霉素衍生物）失活

l hygr 使潮霉素β失活。

第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，从而便于筛选。决定能不能放置目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源 DNA 片段。一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。

第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即称为表达载体。选用哪种载体，还是要以实验目的为准绳。

启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 是表达载体核心完整表达盒，只有同时具备整套元件，载体才能在宿主内完成基因转录 + 蛋白翻译。

l 启动子：促进 DNA 转录的 DNA 顺序，这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。

l 增强子/沉默子：为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。

l 核糖体结合位点/起始密码/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是 AUG（起始密码）和 SD 序列。

l 转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down－stream 有一段 GT 或 T 富丰区，这 2 部分共同构成 poly（A）加尾信号。

载体的选择主要考虑以下几点：

1. 构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

2. 载体的类型：

克隆载体：依据插入克隆片段大小选择克隆能力匹配的载体，片段小选小载体，片段大选大载体；例如片段＜10 kb 可选择质粒。

表达载体：根据受体细胞类型选择，分为原核、真核、穿梭载体，如大肠杆菌表达载体、哺乳类细胞表达载体。

原核表达载体需重点注意：选择适配的启动子以及对应的受体菌；表达真核蛋白时，需要克服相关表达困难，同时避免阅读框错位；根据实验需要，选择适合表达天然蛋白或者融合蛋白的载体。

3. 载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。

选用质粒（最常用）做载体的 4 点要求：

l 选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5 kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；

l 一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10 个以上的拷贝，而严谨型质粒 < 10 个。

l 必须具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；

l 必须有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr。

无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。

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