多重荧光免疫组化--TSA技术

传统病理学一直是疾病诊断的基石，依靠对组织切片进行定性或半定量的视觉检查来检测病理变化。单重免疫组化（IHC）虽然能有效检测特定生物标志物，但常受限于单一标志物，这限制了其捕捉组织环境复杂性的能力。多重成像技术的引入，如多重 IHC 和多重荧光免疫组化技术 (mIHC)，具有革命性意义，能够在一个组织切片中同时可视化多个生物标志物。这些方法将形态学与定量多标志物数据及空间背景相结合，提供了更全面的细胞相互作用和疾病机制视图。

图 1. 展示每种多重荧光免疫组化方法的机制示意图^[1]

明场多重染色IHC

为了在明场显微镜下对 FFPE 组织进行 mIHC，可以使用多种显色剂/酶。先给切片中的第一个靶点用一种特异性抗体结合靶点，再通过酶促反应让结合部位呈现特定颜色。之后洗掉多余的抗体，再换第二种抗体结合第二个靶点，让它呈现另一种颜色。重复这个过程，就能在普通光学显微镜下，看到不同靶点被不同颜色标记，清晰对应组织的形态结构。这种方式的最大优势就是直观，可以一边观察组织细胞的正常形态，一边看靶点的分布。

表 1. 多重免疫组化检测中的典型显色底物^[2]

底物	催化剂	颜色
DAB	HRP	棕色
DAB + Ni	HRP	黑色
AEC	HRP	红色
VIP	HRP	紫色
NBT/BCIP	AP	深蓝色
Vulcan Fast Red	AP	红色
Vector Black	AP	黑色
Nova Red	HRP	深红
TMB	HRP	蓝

明场多重标记虽具备可行性，但需重点考量多个关键因素。核心问题在于，抗体需分别与 HRP 或 AP 偶联以避免交叉反应，这直接限制了多重标记的能力。连续的串行 IHC 检测易导致组织降解，进一步限制了多重标记的效果，同时还存在显色重叠风险，甚至可能出现一种颜色被另一种掩盖的情况，尤其显色光谱的重叠，大幅制约了明场显色多重标记的应用程度。因此，实际能稳定检测的靶标数量通常难以超过3个，而且信号没有放大效果，对于含量极低的微量靶点，颜色会淡得几乎看不见。

荧光多重标记

为了突破明场染色的局限，荧光多重染色应运而生。不再使用有色染料，而是给抗体偶联荧光基团。不同靶点的荧光基团波长不同，在荧光显微镜下，这些基团会各自发光，哪怕同时标记 5-6 个靶点，也能清晰区分它们的位置，尤其适合观察多个靶点的空间关系。

但荧光染色也有短板。一方面，荧光分子本身的信号强度有限，微量靶点的荧光信号还是太暗；另一方面，不同波长的荧光信号可能会串色，比如红光的光晕覆盖了绿光区域，导致判断失误。更关键的是，荧光分子容易褪色，观察时需要快速记录，否则信号会越来越弱。

酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术的问世，为荧光多重染色提供了高效的信号放大解决方案，有效破解了传统技术面临的诸多局限。其核心原理在于，一抗与靶点特异性结合，偶联有辣根过氧化物酶 HRP 的二抗与一抗结合后，向反应体系中引入携带荧光基团的酪胺分子。荧光标记的酪胺盐在 HRP 催化过氧化氢的条件下会产生共价键结合位点，进而引发大量酶促反应。这些反应产物能够与周围蛋白（如色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基所在的蛋白）相结合，在抗原-抗体结合处堆积大量荧光素，使信号强度实现数十倍的提升，即便低丰度靶点也能被精准检测。

TSA 技术的显著优势之一是具备高度特异性。酪胺分子的聚合反应严格限定于 HRP 所在的靶点区域，不会向其他无关部位扩散，从根本上杜绝了信号交叉干扰的现象。同时，TSA 标记产生的荧光信号稳定性优异，抗淬灭能力强，为后续的观察与成像工作提供了良好条件。此外，该技术与多种荧光染料具有良好的兼容性，能够进一步拓展荧光染色的靶点数量上限，最多可同时标记 8-10 个靶点，实现对病理切片多靶点的全面检测。在科研领域，TSA 技术助力研究人员清晰解析肿瘤细胞与免疫细胞的相互作用机制。在临床诊断中，其可辅助医生更精准地鉴别肿瘤亚型，为个体化治疗方案的制定提供可靠的实验依据。

从明场多重染色到 TSA 赋能的多重荧光染色，多重 IHC 技术的核心追求始终是 “更清晰、更灵敏、更精准” 地看见靶点。如今，TSA 已经成为荧光多重染色中不可或缺的关键技术，它不仅让靶点检测的灵敏度和准确性大幅提升，也让多重 IHC 技术的应用场景越来越广泛 —— 从肿瘤研究到自身免疫性疾病诊断，从基础科研到临床转化，它都在帮助我们 “看透” 组织切片背后的生物学真相，为疾病的诊断和治疗提供更有力的支持。

Enkilife恩玑生命不仅为客户提供TSA多重标记全套试剂盒，还提供多种TSA特色技术服务，包括IF荧光染色、荧光全景扫描、超多标染色、病理分析（5标及以下）。

产品	货号
TSA六标七色多重荧光染色试剂盒	RA10012
TSA五标六色多重荧光染色试剂盒	RA10011
TSA四标五色多重荧光染色试剂盒	RA10010
TSA三标四色多重荧光染色试剂盒	RA10009
TSA双标三色多重荧光染色试剂盒	RA10008

参考文献

1. Sheng W, Zhang C, Mohiuddin TM, Al-Rawe M, Zeppernick F, Falcone FH, Meinhold-Heerlein I, Hussain AF. Multiplex Immunofluorescence: A Powerful Tool in Cancer Immunotherapy. Int J Mol Sci. 2023 Feb 4;24(4):3086. doi: 10.3390/ijms24043086. PMID: 36834500; PMCID: PMC9959383.

2. Stack EC, Wang C, Roman KA, Hoyt CC. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 2014 Nov;70(1):46-58. doi: 10.1016/j.ymeth.2014.08.016. Epub 2014 Sep 19. PMID: 25242720.