EnkiLife（恩玑生命）带你全面了解WB(Western blot、蛋白免疫印迹)实验！

一、什么是WB?

WB（Western blot），即蛋白质免疫印迹法，它常被称为蛋白质分析的“金标准”，广泛应用于医学研究、药物开发和法医鉴定等领域。

简单来说，它就像一个“分子筛”加上一个“特异性探针”：首先把蛋白质按大小分开，然后用一种能特异性识别目标蛋白的“探针”去捕获它。

二、为什么要做WB（Western blot）?

一句话：做WB（Western blot）是为了“看见”并验证某个蛋白质是否真的存在、有多少、是否被修饰。它几乎是所有生命科学研究的“标配”实验，离开它，很多结论就缺了“最后一公里”的证据。

下面把“为什么要做WB（Western blot）”拆成6个真实场景，看完就知道它在研究链里扮演什么角色。

1.验证基因操作是否“落地”到蛋白
? 敲除/敲低/过表达某个基因后，mRNA变化≠蛋白变化。
? 只有WB（Western blot）能告诉你：这条带是消失了、变弱了，还是变强了。
? 缺WB（Western blot），基因功能研究只走到“半场”。

2.给组学数据“验真身”
? 转录组、蛋白质组筛到差异分子后，必须挑几个关键蛋白做WB（Western blot）复核。
? 期刊审稿人几乎必问：“Provide Western blot validation”。
? WB（Western blot）是组学故事的“质检章”。

3.定位信号通路“哪一环被激活/抑制”
? 磷酸化抗体WB（Western blot）可一眼看出：MAPK、AKT、NF-κB…哪条轴被点燃。
? 用“磷酸化/总蛋白”灰度比，可定量活性变化。
? 没有WB（Western blot），信号通路图只能是“虚线”。

4.比较不同样本/处理/时间点的蛋白表达量
? 药物处理、缺氧、热激、放疗、感染…WB（Western blot）给出半定量柱状图。
? 配合内参校正，可做统计学差异。
? 让“表型”与“分子”真正挂钩。

5.评价抗体/标记基因是否“靠谱”
? 新抗体上市，厂家数据可能“美颜”。
? 自己跑WB（Western blot），一条干净条带=抗体特异性过关。
? 避免下游免疫荧光、IP、ChIP全部翻车。

6.临床前/临床样本的分子标志物初筛
? 血清、活检、PDX模型，先用WB（Western blot）快速验证候选标志物是否值得开发ELISA或IHC。
? 成本低、通量中等、周期短。
? 转化医学的“桥头堡”。

一句话总结，WB（Western blot）是把“基因”、“组学”、“表型”串成故事的那根“蛋白级”证据链；少了它，很多结论只能停留在“推测”阶段。

三、WB（Western blot）的原理及实验操作步骤

1. 原理：SDS 给蛋白“穿相同负电荷外衣”→ 电泳按分子量“排队”→ 电场把队伍“复印”到膜上→ 抗体“夹心”标记目标蛋白→ 化学发光“拍照”。
即：“变性分离—转印—免疫识别—信号显影” 四连跳。

2.WB（Western blot）实验操作步骤

下面按“症状→原因→急救/预防”三栏速查，实验台 3 min 内就能对症换药或改条件。

1. 无信号（白板）

? 原因 1：蛋白本来就低丰度 + 上样量 ≤10 μg
→ 急救：加到 30–50 μg；或富集（IP、亚细胞组分）。
? 原因 2：抗体失效/稀释过稀
→ 急救：新抗体 1:200 起步梯度摸；老抗体加 0.02 % NaN? 的 4 °C 存 1 个月即弃。
? 原因 3：转膜反向或 PVDF 未甲醇激活
→ 急救：丽春红染膜看是否有蛋白；反向重转。
? 原因 4：HRP 底物失活
→ 急救：ECL A/B 各滴一点到枪头尖，暗室看是否闪蓝光；不闪即换。

2. 高背景（全膜黑）

? 原因 1：封闭不足/奶粉过期
→ 预防：5 % 脱脂奶粉新鲜配，4 °C 不超过 3 天；磷酸化改用 3 % BSA。
? 原因 2：一抗浓度过高
→ 急救：梯度 1:500–1:2000 重摸；高背景立刻多洗 3×10 min + 0.1 % Tween-20。
? 原因 3：二抗交叉反应
→ 预防：同物种 IgG 预吸附二抗；室温 1 h 缩短到 45 min。
? 原因 4：膜干
→ 急救：显影过程保持膜湿润，曝光完立即 TBST 泡。

3. 杂带/多条带

? 原因 1：抗体特异性差
→ 急救：siRNA 敲减或 KO 样本跑对照，杂带不消失→换抗体。
? 原因 2：蛋白降解
→ 预防：RIPA 加蛋白酶抑制剂 + 1 mM PMSF；样品煮沸后 ?20 °C 不超过 1 周。
? 原因 3：二聚体/糖基化
→ 验证：样品 + β-ME 100 °C 10 min 再跑；或 PNGase F 去糖基化看条带下移。

4. 条带扭曲（笑脸、拖尾）

? 原因 1：胶不聚合或 APS/TEMED 失效
→ 预防：APS 4 °C 存 1 个月即弃；插梳前看界面是否消失。
? 原因 2：上样量 >50 μg/孔或盐浓度过高
→ 急救：BCA测定后稀释到相同 RIPA 浓度；脱盐柱处理。
? 原因 3：电泳过热
→ 预防：恒压 80 V 积层，后 100 V 分离；冰浴循环水或换缓冲液。

5. 定量飘忽（三次重复误差 >30 %）

? 原因 1：内参条带饱和
→ 急救：内参上样 5 μg 起步，曝光灰度 0.3–0.7 线性区；饱和即再稀释样品。
? 原因 2：转膜不完全
→ 验证：转膜后考马斯染胶 + 丽春红染膜，残留 >20 % 重摸转膜时间/电流。
? 原因 3：strip 过度
→ 预防：50 °C 15 min 即可；磷酸化蛋白建议同膜不同荧光通道（免 strip）。

6. 特殊翻车彩蛋

? ECL 底物“闪一下就消失”——信号太快来不及拍
→ 换用 Pierce SuperSignal Femto 长辉型，或 CCD 成像仪连拍 30 帧自动叠加。
? 磷酸化条带“今天有明天无”——样品反复冻融
→ 分装 20 μl/管，一次用完；液氮速冻 ?80 °C。
? 膜上现“幽灵条带”——之前 strip 残存 HRP
→ strip 后加 3 % H?O? 室温 15 min 灭活 HRP，再封闭。

WB（Western blot）翻车 90 % 是“浓度、时间、温度”三角失衡导致，并常因流程复杂、结果不稳定成为科研痛点。为此，EnkiLife（恩玑生命）全新推出的2h极速WB即用型全流程试剂盒，不仅将实验时间缩短至2小时，更通过创新设计确保结果高度可重复。

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2. 全流程优化：从样本处理到显色曝光一体化解决方案，无需额外试剂。

3. 结果可靠：优异重复性和批次一致性，CV值<5%，实验间差异极小。

4. 快速孵育技术：专有快速封闭液和抗体稀释液，封闭仅10分钟，一抗15分钟，二抗5分钟。

5. 即用型设计：预制胶、即用Marker和预配颗粒，开盒即用，简化实验准备。

6. 实验安全：即用预制胶，无异味缓冲液，避免接触丙烯酰胺等有毒试剂。

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