酪酰胺信号放大(TSA)技术

1. TSA 技术简介

酪酰胺信号放大（TSA，Tyramide Signal Amplification）技术是一类基于酶促催化反应的高灵敏度原位检测技术，其核心机制是利用辣根过氧化物酶（HRP）的高效催化活性，对样本中的靶蛋白或核酸分子进行特异性、高密度标记。作为突破传统检测技术灵敏度瓶颈的关键手段，TSA 技术通过独特的信号放大效应，能够在荧光免疫细胞化学（ICC）、免疫组化（IHC）和原位杂交（FISH）等多个核心应用场景中，显著增强靶标相关荧光信号的强度。相较于传统检测方法，该技术可有效捕捉到低丰度靶标 —— 包括样本中微量表达的功能蛋白、稀有细胞表面标志物、低拷贝核酸片段等传统手段难以检出的目标分子，为生命科学研究与临床诊断提供了更精准、更全面的检测解决方案，广泛适配石蜡切片、冷冻组织、细胞样本、类器官等多种样本类型的检测需求。

2. TSA 技术检测原理

TSA技术是利用酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，结果使其检测信号得到10-100倍增强。简单来说，是利用二抗上带有的HRP，来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。之后洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物，重复下一种一抗-二抗-HRP进行第二轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说，如果用TSA技术，同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行实验，而且信号放大的倍数大大增强。

3. TSA技术的核心优势

TSA 技术基于酪胺分子的酶促聚合反应实现信号放大，其独特的技术原理赋予了它远超传统技术的核心竞争力，也成为科研与临床工作者选择它的关键原因：

• 信号放大能力突出，精准捕捉低丰度靶点

TSA 技术的核心突破在于 “酶促信号放大” 机制。当 HRP（辣根过氧化物酶）标记的二抗与一抗结合后，加入携带荧光基团的酪胺分子，HRP 会催化酪胺分子快速聚合，并稳定结合于靶点周围的蛋白质上。这一过程相当于将 “单个荧光分子标记” 转化为 “多个荧光分子聚合标记”，信号强度可提升数十倍甚至上百倍。这种强大的放大能力，使得 TSA 技术能够清晰检测到传统 IHC 无法捕捉的低丰度靶点，无论是细胞内微量表达的信号通路蛋白，还是稀有免疫细胞表面的特异性抗原，都能被精准 “点亮”，为疾病早期诊断、潜在治疗靶点筛选提供关键依据。

• 多重标记能力升级，实现多靶点全景式解析

TSA 技术的高度特异性是其突破多重标记限制的核心。酪胺分子的聚合反应严格限定于 HRP 所在的靶点区域，不会向其他无关部位扩散，从根源上避免了信号交叉干扰。同时，TSA 兼容多种不同波长的荧光染料，结合其信号放大优势，可实现 8-10 个靶点的同步标记，远超传统技术的多重标记上限。例如在肿瘤免疫微环境研究中，通过 TSA 技术可同时标记 CD3（T 细胞）、CD8（细胞毒性 T 细胞）、PD-L1（免疫检查点分子）、CK（肿瘤细胞）、VEGF（血管生成因子）等多个标志物，清晰呈现免疫细胞浸润模式、肿瘤细胞与免疫细胞的交互位置、PD-L1 的表达定位等多维度信息，为解析肿瘤免疫逃逸机制提供 “全景式” 数据，这是传统技术难以实现的。

• 温和操作保护样本，提升结果稳定性与样本利用率

Enkilife的TSA试剂盒配套的抗体洗脱剂采用温和配方，无需依赖高温微波处理，即可在去除未结合抗体的同时，完整保留靶点抗原与已标记的荧光信号。这种温和洗脱方式可实现 5-7 轮循环染色，且每一轮循环后组织形态仍能保持完整，大幅降低了样本损伤风险。对于珍贵样本而言，TSA 技术的这一优势尤为重要，仅需一张切片即可完成多个靶点的同步检测，无需制备大量切片，最大化利用样本价值。同时，避免了多切片染色带来的批次误差，使得多个靶点的表达数据基于同一组织背景，可比性更强，结果更可靠。配套的荧光素稳定性高，不易淬灭，在实验操作过程中无需严格避光，染色后的玻片可低温保存数月之久。

• 广泛适配性与场景兼容性，降低技术应用门槛

TSA 技术并非局限于特定样本或检测场景，而是具有极强的通用性。样本类型上，可适配石蜡切片、冷冻切片、细胞爬片、细胞涂片、组织芯片、类器官等多种生物样本。检测模式上，可与荧光显微镜、共聚焦显微镜等常用设备兼容，无需额外购置专用仪器。此外，TSA 技术打破了传统多重染色的种属限制，Enkilife的TSA试剂盒同时配套二抗，可兼容兔、鼠多物种一抗，进一步拓展了实验设计的灵活性。无论是基础科研中的机制探索，还是临床诊断中的精准分型，TSA 技术都能快速适配需求，降低技术应用的门槛。

4. TSA技术应用领域

TSA 技术的优势并非停留在理论层面，其在实际应用中的卓越表现，进一步印证了选择它的必要性：

• 科研领域应用

a) 分子机制研究：包括 DNA 损伤与修复通路解析、蛋白质相互作用、信号通路中低丰度蛋白检测等，助力精准捕捉生物分子的动态变化与调控关系。

b) 细胞与组织学分析：通过免疫荧光（IF）、免疫组化（IHC）实现细胞亚群鉴定、低丰度标志物定位，以及神经递质与受体的空间分布研究，为神经科学、发育生物学等领域提供清晰可视化数据。

c) 核酸检测与定位：结合原位杂交（ISH/FISH）增强低拷贝 RNA、非编码 RNA 及异常 DNA 片段的信号，支撑基因表达调控、染色体异常机制等分子遗传学研究。

d) 前沿组学研究：作为空间转录组学与空间蛋白质组学的核心技术支撑，实现基因与蛋白质的高分辨率空间定位，助力组织微环境解析、肿瘤异质性研究、器官功能分区图谱构建等。

e) 细胞分选与分析：在流式细胞术中放大低丰度细胞表面标志物信号，精准区分稀有细胞亚群，支持免疫细胞分型、干细胞研究等。

• 临床领域应用

a) 病理诊断与分型：通过免疫组化多重染色，在石蜡切片、冷冻切片等临床样本中同步检测多个肿瘤标志物、免疫细胞标志物，辅助肿瘤亚型鉴别、病理分级及预后评估。

b) 疾病早期筛查：基于生物传感技术开发高灵敏度检测平台，捕捉疾病早期微量异常的生物标志物（如肿瘤标志物、自身抗体），为癌症、自身免疫性疾病等的早期预警提供依据。

c) 治疗方案指导：通过分析肿瘤免疫微环境中免疫检查点分子、免疫细胞浸润特征，或检测药物作用靶点的表达水平，为靶向治疗、免疫治疗方案的选择与疗效评估提供精准数据。

d) 微量样本检测：适配临床穿刺样本、胸腔积液细胞、骨髓涂片等珍贵 / 微量样本，在减少样本损耗的前提下实现多靶点同步检测，提升临床样本的利用率与检测性价比。

e) 分子异常检测：结合 FISH 技术增强低丰度致病基因、染色体异常片段的信号，辅助遗传病、肿瘤相关基因变异的临床诊断。

5. TSA分析方法

多重IHC巧妙融合了定性、定位、定量与互作分析四大核心优势，借助 TSA 技术高效的信号放大效应与特异性标记能力，依托各类分析软件，如 HALO、Oncotopix、QuPath 等主流平台，既能精准识别组织样本中目标抗原的种类与表达状态，清晰明确其在细胞及亚细胞水平的具体分布位置，又能通过标准化定量分析获取抗原表达的精准数值，同时还能深入探究不同抗原之间的空间邻近关系与功能互作模式，让科研与临床工作者在单张切片上即可获得多维度、立体化的生物分子信息，为疾病机制研究、诊断标志物筛选及治疗效果评估提供全面且深入的技术支撑。

a) HALO (Indica Labs, Albuquerque, New Mexico, USA, https://www.indicalab.com/halo/)是数字病理学中用于定量组织分析的图像分析平台。该软件支持图像对齐、分割、测量、定量分析、热图分析、细胞计数和蛋白质表达分析，以及细胞分选和过滤功能。HALO还附带了无数附加组件，如用于自动组织分割的组织分类器、用于使每个细胞的蛋白质和基因表达谱上下文化的FISH-IF量化、用于识别细胞相对空间分布的空间分析、用于批量分析整个载玻片TMA图像的组织微阵列附加组件，以及用于分析染色的连续切片以获取额外IHC标记的连续切片分析。这些附加组件还与各种图像和数字幻灯片格式兼容，即JPG、TIF、ND2、MRXS、QPTIFF、分量TIFF、VSI、NDPI、NDPIS、SVS、AFI、CZI、SCN、LIF和BIF。更重要的是，HALO本身与Vectra和Insituplex兼容，并经常作为推荐的成像平台使用。

b) Oncotopix（Visiopharm, Hoersholm, Denmark; https://www.visiopharm.com/）是一款市售定量数字病理图像分析软件。通过整合图像分析、机器学习及人工智能技术，可高效完成海量数据集的分析、管理与报告生成，且能与实验室信息管理系统无缝对接，兼容所有图像 / 切片格式。与同类软件相比，该软件的显著优势在于已获体外诊断（IVD）认证，作为合规设备应用于乳腺癌、肺癌等多种临床检测场景。Oncotopix 搭载的 “浸润性肿瘤检测应用程序（Invasive Tumor Detection APP）” 可实现浸润性肿瘤的自动化精准检测，其整合完整生物标志物分析流程，能自动识别病变热点区域、量化生物标志物表达水平，并可视化呈现肿瘤异质性。

c) HistoCAT 是一款可免费访问的交互式计算平台，能够对高度多重化、单细胞分辨率的组织样本进行定量分析。该平台整合了高维图像可视化技术、细胞表型特征分析方法，以及用于全面研究复杂组织内细胞间相互作用与细胞社交网络的创新算法。此外，HistoCAT 还搭载了一种创新算法，该算法能够检测出比随机概率预期更频繁发生的邻近细胞间相互作用，并在整个数据集及队列中识别出更具显著性的相互作用关系与独特的细胞微环境。不过，HistoCAT 在组织分割功能上存在局限性，需与 CellProfiler等其他细胞分割软件配合使用。

d) QuPath (https://qupath.github.io)是另一款适用于全切片图像分析的高通量免费图像分析软件，具备强大的批量处理与脚本编写功能。该软件能够处理大规模全切片成像数据，无需通过裁剪或下采样将图像数据调整至可处理大小，即可开展后续分析。但该软件在对具有复杂染色模式的生物标志物（如错配修复蛋白、PD-L1 等免疫检查点抑制剂）进行数字评分时存在一定局限性。因为此类生物标志物的染色涉及肿瘤细胞与免疫细胞等多种细胞群体，而斑驳的染色分布模式显著增加了两类细胞染色信号的区分难度。

表1 一些常用的多重IHC/IF分析平台

Enkilife恩玑生命不仅为客户提供TSA多重标记全套试剂盒，还提供多种TSA特色技术服务，包括IF荧光染色、荧光全景扫描、超多标染色、病理分析（5标及以下）。