文献分享：多重免疫荧光表征肿瘤免疫微环境

文献分享：多重免疫荧光表征肿瘤免疫微环境

背景

肿瘤免疫微环境（TME）的细胞组成、功能状态及空间分布是决定肿瘤进展与免疫治疗疗效的核心因素，精准解析TME特征已成为肿瘤研究的关键方向。然而，传统研究工具存在显著局限：单一免疫组化（IHC）仅能检测单靶点，无法呈现细胞间的互作关系；流式细胞术虽可实现多参数分析，但需解离细胞，丢失了至关重要的空间信息；早期多重荧光染色技术则受限于信号强度低、抗体物种兼容性差等问题，难以满足临床样本分析需求。在此背景下，基于酪酰胺信号放大（TSA）技术的多重免疫荧光（mIHC）平台应运而生，为TME的“全景式”解析提供了可能。

Viratham Pulsawatdi A 团队在《Molecular Oncology》上发表了题为 “A robust multiplex immunofluorescence and digital pathology workflow for the characterisation of the tumour immune microenvironment” 的研究，该研究以结直肠癌（CRC）福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织为研究对象，基于TSA技术的 Opal 多重免疫荧光平台，构建并验证了一套从染色到图像分析的标准化流程，为肿瘤免疫微环境的精准表征提供了可靠方法。以下从技术本质、实验逻辑、核心发现及应用价值展开深度解析。

一、技术核心：多重免疫荧光TSA技术的原理与优势

TSA技术是mIHC实现高灵敏度检测的核心。其原理基于辣根过氧化物酶（HRP）催化反应：HRP与一抗结合后，催化酪酰胺分子发生氧化聚合，使荧光信号在抗原位点高效富集，实现信号放大。与传统IHC相比，该技术突破了以下瓶颈：

l  多重标记可行性：通过“一抗结合-信号放大-抗原变性”的循环流程，可在同一张组织切片上依次检测6-8种生物标志物，解决了传统IHC一次仅能检测单一靶点的局限。

l  高灵敏度特性：对低表达生物标志物的检测能力显著优于传统荧光染色，信号强度可达传统方法的10-100倍。

l  同物种抗体兼容性：TSA的信号放大不依赖抗体来源物种，可使用同一物种来源的多种一抗，大幅拓展了抗体选择的灵活性。

本研究中，Opal染料作为TSA技术的核心载体，通过与不同荧光通道匹配，结合多光谱成像与解混技术，实现了多重信号的精准区分，为后续数字分析奠定基础。与单一染色IHC、流式细胞术等技术相比，本研究采用的多重免疫荧光TSA技术展现出独特优势：

l  空间信息保留：在检测多重生物标志物的同时，完整保留组织形态和细胞空间定位关系，这是流式细胞术无法实现的，对分析肿瘤免疫细胞浸润模式至关重要。

l  定量准确性：结合数字图像分析软件QUPATH，可对免疫细胞表型进行定量统计，与传统IHC的相关性系数r?>0.9，验证了其定量可靠性。

l  高通量适配性：通过自动化染色仪和全切片扫描仪，实现从染色到成像的自动化操作，单样本从组织切片到结果输出可在24小时内完成，适配大样本队列研究。

二、实验设计

研究针对mIHC实验中“染色质量不稳定”“图像分析易产生偏差”等关键问题，设计了两种多重检测通道，系统优化并验证流程：

MP1（6重）：CD3、CD4、CD8、CD20、细胞角蛋白（CK）、DAPI，聚焦T细胞亚群与B细胞、肿瘤细胞的共定位分析。

MP2（5重）：CD4、CD68、FOXP3、CK、DAPI，用于解析调节性T细胞（Treg）与巨噬细胞的浸润特征。

三、结果展示

1. 染色顺序优化

系统对比了低免疫浸润与高免疫浸润结直肠癌组织中，CD20、CD3等5种生物标志物在反复热诱导表位修复（HIER）后阳性细胞的检出率。

结果显示：a. 表位稳定性存在显著差异：CD20 表位稳定性最高，无需多次 HIER 修复，在第一次检出率稳定；CD3 表位稳定性次之，适合2次HIER 修复；CD4、CD8、CK 表位需多次 HIER 才能充分暴露。b. 免疫浸润水平影响较小：低/高免疫浸润 CRC 组织中，各标志物的表位稳定性趋势一致，说明该优化结果具有普适性。c. 染色位置关联检出效果：CD20 在多次 HIER 后检出率下降，说明表位已经变性；CD4 在第5次HIER 修复检出率达峰值，说明多次 HIER 后表位充分暴露。

该实验明确了 MP1中各抗体的最优染色顺序，解决了多重染色中“表位随 HIER 循环降解”的核心问题，为后续荧光染色的循环流程设计提供了直接依据，避免因染色顺序不当导致的假阴性结果。

2. 验证荧光染色的有效性

该实验通过三方面验证荧光单标技术的有效性：其一，依据抗体 - Opal 染料配对表，采用低丰度标志物（如 CD20）搭配高亮度染料、高丰度标志物（如 CD3、CK）搭配中低亮度染料的策略平衡信号强度，同时为功能相关标志物（如 CD3 与 CD4/CD8）选用光谱分离度高的染料以规避信号串扰；其二，柱状对比图显示，低 / 高免疫浸润结直肠癌组织中 5 种标志物的检测结果，在该技术与传统 DAB 显色免疫组化间高度一致；其三，代表性区域实拍图表明，传统 DAB 染色因细胞密集难以实现精准细胞分割，而荧光染色信号边界清晰，可借助软件准确判定细胞阴阳性。综上，荧光单标技术可替代传统免疫组化用于标志物检测，且在密集细胞区域的定量分析中更具优势，为后续多重荧光染色的可靠性提供了数据支撑。

3. 多重染色的干扰排除与流程确立

图 A 显示优化前 CD20 对 CD8、CK 对 CD4/CD8 存在明显信号干扰，其原因包括 CD20-Opal 650 与 CD8-Opal 690 同属 Cy5 通道引发光谱重叠，以及 CK 与 CD8 染色位置相邻导致的表位交叉反应，对照实验排除了抗体剥离不彻底的干扰。通过调整 Opal - 抗体配对、重排染色顺序（避免 CK 与 CD4/CD8 紧邻）、采用 ER1 温和剥离液等优化措施，信号串扰被完全消除。优化后图 B 中各标志物信号强度处于 20-25 计数的最优区间，所用 MOTIF Opal 染料无光谱重叠且扫描速度提升 20 倍，可满足高通量样本分析需求。

该实验系统解决了多重荧光染色的光谱串扰、表位交叉反应及背景干扰三大核心问题，经 9 轮优化和 40 张切片验证确立的MP1 实验流程，为后续高通量实验提供了稳定可靠的标准化方案。

4. 高通量成像的参数优化

图A通过结直肠癌组织20倍与40倍扫描效果对比，发现20倍扫描的细胞群体检出率差异小于1%，且扫描耗时显著缩短，故确定20倍为标准成像倍数。B为单张切片独立曝光与批量曝光的染色效果对比，发现独立曝光与批量曝光的染色强度无显著差异（相关系数r?＞0.9，P＜0.05），且批量曝光模式可大幅减少成像准备时间，适用于高通量样本处理。C为MP1与MP2两种染色方案的结直肠癌组织对比图，结果发现MP1切片因厚度较大导致自发荧光增强，CK与CD4信号强度弱于MP2切片，因此证明3-4μm为最优切片厚度。D为光谱分解前后的结肠组织对比图，清晰展示CK（绿色）与CD3（黄色）的信号分离效果。

5. 多重荧光染色流程的最终验证

图A展示 9 张连续切片的处理方案（7 张用于传统 DAB 单标免疫组化、2 张用于多重荧光染色）及芯片布局（含 6 种正常组织与羊肺定位组织），B 通过 Spearman 相关分析与 Bland-Altman 一致性分析，系统对比各标志物在两种检测方法中的检出结果。检测结果显示，除 CD8（部分组织表位不稳定）与 FOXP3（表达量＜0.5%）外，其余标志物两种检测方法的相关系数 r?均＞0.9（P＜0.0001），且所有标志物检测偏差均处于 95% 一致性界限内，证实多重荧光染色无系统性偏差，与传统免疫组化具有高度一致性与良好相关性。该图作为核心验证数据，从多组织类型、多标志物及定量一致性三个维度，确证了 MP1 与 MP2 实验流程的可靠性。

6. MP1 检测顺序对表型分析的影响

图A为扁桃体组织芯片的 MP1 染色图，同步呈现 6 种检测顺序下的表型分类饼图、原始染色图及细胞分类图。散点图量化对比不同检测顺序与单标结果的相关性。研究发现，检测顺序对分析结果存在显著影响，优先检测高表达标志物CD20会掩盖邻近低表达标志物CD8的信号，造成 CD20 阳性率高估、CD8 阳性率低估。最终确立的 “CK＞CD4＞CD3＞CD20＞CD8” 最优检测顺序，遵循 “先非免疫细胞标志物、后按泛免疫细胞→T 细胞亚群→B 细胞层级，且将易串扰标志物后置” 的逻辑，其表型分类结果与原始染色高度吻合，且各标志物分析结果与单标结果的相关性达到 r?＞0.9（P＜0.0001）。该图首次阐明检测顺序在多重荧光数字分析中的核心作用，建立基于细胞类型层级的检测顺序原则，有效解决分析方法不当引发的表型分类错误。

7. 从染色到数字图像分析

该分类决策树遵循 “细胞核识别→CK 阴性筛选→CD3 分型→CD4/CD8 细分”的层级化逻辑，保障细胞定义的清晰性。研究通过定制分析脚本实现预期表型与意外表型的全面覆盖，解决了数字分析中的表型漏判问题，新发现的 CD4?/CD8?双阳性细胞亚群为结直肠癌免疫微环境研究提供了新线索，凸显了多重荧光染色技术在挖掘新型生物标志物方面的独特优势。

四、总结

本研究通过系统优化与验证，构建了一套可靠的多重免疫荧光TSA技术工作流程，不仅证实了该技术在肿瘤免疫微环境研究中的核心价值，更为其标准化与临床转化提供了实践路径。其核心启示在于：多重免疫荧光TSA技术的优势不仅源于TSA的高灵敏度，更依赖“实验优化-分析标准化-多维度验证”的全流程控制。未来，随着算法迭代与技术融合，该技术将在“精准医学”领域实现更广泛的价值落地，为疾病机制研究与临床诊疗决策提供有力支撑。

参考文献

Viratham Pulsawatdi A, Craig SG, Bingham V, McCombe K, Humphries MP, Senevirathne S, Richman SD, Quirke P, Campo L, Domingo E, Maughan TS, James JA, Salto-Tellez M. A robust multiplex immunofluorescence and digital pathology workflow for the characterisation of the tumour immune microenvironment. Mol Oncol. 2020 Oct;14(10):2384-2402. doi: 10.1002/1878-0261.12764. Epub 2020 Sep 1. PMID: 32671911; PMCID: PMC7530793.

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