WB、ELISA、IHC 三大免疫学实验对比详解
发表时间：2025-12-17WB（蛋白免疫印迹）、ELISA（酶联免疫吸附试验）、IHC（免疫组织化学）是生命科学领域最常用的三大免疫学检测技术，三者在定性、定量、定位的功能上各有侧重，以下是结构化的对比和详细说明：
一、核心原理一句话
1. WB：先 SDS-PAGE 按分子量分离开→转膜→抗体显色，兼顾“大小”与“有无”。
2. ELISA：抗原或捕获抗体包被微孔板→免疫-酶放大→底物显色，信号强度与浓度成正比，可绝对定量。
3. IHC：组织/细胞切片上原位抗原-抗体结合→酶/荧光显色→显微镜下看“定位”，可形态-功能结合。
二、横向对比一览表
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技术 |
WB（蛋白免疫印迹） |
ELISA（酶联免疫吸附试验） |
IHC（免疫组织化学） |
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样本 |
细胞裂解液/组织匀浆 (一般提取总蛋白，变性状态) |
血清/血浆/培养上清 (液体样本，天然 / 变性均可) |
组织块/细胞爬片的原位蛋白(保持空间结构，天然状态) |
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核心能力 |
检测蛋白是否存在及分子量 (MW) |
高灵敏度定量 (pg/mL 级别) |
显示抗原在细胞内的确切位置 (核/膜/浆) |
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读数 |
胶片或 CCD 采集条带灰度；以内参（β-actin、GAPDH 等）做归一化，得到“相对表达量” |
酶标仪测 OD 值，用标准品绘制 4-PL 曲线，算出绝对浓度（pg/mL–μg/mL） |
可用数字切片软件半定量 |
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定量能力 |
只能半定量（同一膜内比较，不同膜间误差大）；绝对定量需要体外合成蛋白做标准曲线，极少做 |
定量王者，动态范围 2–3 个数量级；适合体液批量筛查 |
定性首选，唯一能把蛋白放在组织学背景里看——细胞膜/浆/核/间质一目了然；可联合 HE 或荧光多标 |
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灵敏度 |
中～高（1–10 ng 级，ECL 显色） |
高（常规 1–100 pg/mL，高敏可达 0.1 pg/mL） |
中（比 WB/ELISA 低 1–2 个数量级，受固定、修复、内源生物素影响大） |
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耗时 |
1–2 d |
2–6 h |
1–3 d（含染色+扫描） |
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设备要求 |
电泳/转膜/成像 |
酶标仪 |
切片机+显微镜 |
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优点 |
给出分子量、剪切体/修饰带型；可同时检测磷酸化/总蛋白 |
精准、快速、适合高通量；标准曲线让结果可跨实验比较 |
可定位至组织区域、细胞甚至亚细胞结构，形态-功能结合；可回顾性研究（存档蜡块 10 年仍可用） |
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缺点 |
无法直接看到蛋白在细胞内的位置；步骤多、耗时 1–2 d；抗体交叉反应难排除 |
无法定位，无法区分蛋白修饰形式 |
主观性强；抗体验证要求极高（敲除组织、抗体梯度、阳性/阴性对照）；定量重复性差 |
三、如何按实验目的快速选型
1. 只想知道“我的目标蛋白在细胞里表达没？”
先跑 WB(Western blot)：一条带就能确认有无，还能看分子量对不对。
2. 后续要做动物或临床样本，需要测血清中炎症因子浓度？
直接买商品化 ELISA 试剂盒，1 d 出绝对浓度，高通量又省样本。
3. 课题是“肿瘤微环境中 PD-L1 在哪类细胞表达？”
必须 IHC（或荧光 mIHC）：把癌巢、浸润免疫细胞、基质分开看，还能联合 CD3/CD68 做多标。
4. 想比较两种处理对某蛋白的“表达量+定位”变化？
WB(蛋白免疫印迹) 测总量变化 + IHC 看分布变化，两者互补发一篇完整的机制图。
5. 需要“浓度+定位”双保险？
ELISA + IHC 联合，即ELISA 定量、IHC 看表达部位。
四、关键共性与注意事项
1. 抗体特异性：三者均依赖高质量的一抗，需提前通过抗体说明书确认适用的实验平台（部分抗体仅适用于 WB，不适用于 IHC）；
2. 对照设置：
- WB 需设阳性 / 阴性对照、内参对照；
- ELISA 需设标准品、空白对照、复孔对照；
- IHC 需设阳性组织对照、阴性对照（如 PBS 替代一抗）。
Western blot实验流程一览图：
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