多重免疫荧光实验指南及常见FAQ
发表时间：2025-12-23一、三步锁定最优技术方案
第一步：明确核心需求——判断是单一靶标定性，2-3个靶标共定位还是3个以上靶标网络解析。
第二步：匹配技术性能——高丰度单靶标选IHC，2-3个靶标选普通IF，复杂多靶标或低丰度靶标必选TSA。
第三步：权衡成本与效率——IHC成本最低、周期最短；普通IF成本中等、周期较短；TSA成本较高、周期较长，但数据价值远超成本投入。
二、关键技术要点：
- 抗原修复：抗原修复通常使用1×柠檬酸（PH6.0）或EDTA（PH9.0）作为修复液，高温高压修复，将切片至于高压锅中，加入适量的修复液，关上高压锅，待上汽后计时 2min，冷却至室温，修复完毕。【如遇骨组织、脑组织等易掉片组织，则采用微波修复，修复温度控制在 80℃左右，修复液可用2×柠檬酸（PH6.0）。】
- 内源性酶阻断：用纯水配制3%H2O2溶液，将切片放于溶液中，室温孵育20min。如遇易掉片组织，可适当降低H2O2的孵育时间。
- 抗体选择与稀释：优先使用单克隆抗体。如果是小鼠样本，尽量避开选择小鼠来源一抗，若选择小鼠一抗，二抗除了与一抗结合，还会结合组织内源性的IgG，产生非特异性着色。一抗稀释比例需通过预实验确定，浓度过高易导致非特异性结合，过低则信号微弱。建议设置浓度梯度筛选最佳条件。
- TSA 染料使用规范：TSA 染料为光敏性物质，工作液需现配现用。低表达靶标选择荧光强度高、抗淬灭性强的染料（如 Cy5、AF594），利用 TSA 信号放大效应增强检出率。高表达靶标选择荧光强度适中的染料（如 FITC、Cy3），避免信号饱和掩盖细节。
- 避免光谱重叠：选择发射波长间隔≥50nm 的染料组合，例如：DAPI（461nm）+ AF488（519nm）+ Cy3（570nm）+ Cy5（670nm），可有效减少串色。避免同时使用 FITC（520nm）和 AF488（519nm）、Cy3（570nm）和 AF594（617nm）。
- 结合成像设备：荧光型 TSA 需确认荧光通道是否与实验室显微镜波长兼容。普通荧光显微镜时，共聚焦和多光谱显微镜均可以使用，实验前需确定自己仪器的通道/滤光片数量，优先选择跟仪器滤光片匹配的荧光染料。
- 抗体洗脱效率：如果有些抗体效价高，亲和力较强，不易洗脱彻底，可增加洗脱次数，在操作过程应注意切片平放。易脱片样本可降低洗脱液温度或缩短孵育时间。
三、多重免疫荧光实验常见FAQ
1. 多重标记实验时，如何确定需要使用几色荧光标记？
答：①靶标需求：靶标总数决定最低色数，低丰度和互作靶标需独立通道，无关联靶标可分批次检测。②仪器能力：确定自己仪器的通道/滤光片数量，优先选择跟仪器滤光片匹配的荧光染料。③实验可行性：色数越多串扰、成本、分析难度越高。珍贵样本需多色，普通样本可少色分批次。④参考规范：借鉴同类研究及试剂厂商建议，优先保障核心靶标通道。
2. 免疫荧光，两个同种属抗体该怎么染？
答：可选择TSA 双标三色方案，先完成第一个靶标的 TSA 染色并进行抗体洗脱，避免二抗交叉结合。再进行第二个靶标的 TSA 染色，最后加核染。
3. TSA实验时一二抗如何洗脱？
答：通常使用EDTA（pH9.0）或柠檬酸修复缓冲液（pH6.0）进行高温高压洗脱。针对一些容易掉片的组织，可以选择温和洗脱方式，如采用抗体洗脱液，室温/37℃孵育5-15min即可。
4. 染第二轮时第一轮易掉色如何处理？
答：可能是因为荧光底物不稳定、化学试剂损伤或抗原流失。解决方法如下：①选用共价结合型 TSA 底物（如 Alexa Fluor 系列）；②抗体洗脱时采用更温和的洗脱方式或使用抗体洗脱液；③延长第一轮底物孵育时间，选用高强度底物提升初始信号；④或调整染色顺序，优先染高稳定性靶标，将易掉色抗原放在最后一轮染色。
5. 与普通荧光实验对比一抗稀释比例为多少？
答：首先，可以直接采用传统组化中确定的最优稀释度进行测试，作为对照组。若结果不理想，可进一步设计倍比稀释梯度，以探索TSA系统中一抗稀释度的敏感性与特异性平衡。
6. 荧光二抗染色效果不好可以使用TSA染色吗？
答：可以使用 TSA 染色，且 TSA 技术正是解决普通免疫荧光效果差的核心方案之一。因为两者的染色原理不同，TSA 通过 HRP 催化酪胺荧光底物在靶标上共价沉积，实现信号级联放大，能显著提升低丰度靶标的检出率，弥补荧光二抗染色信号弱的问题。同时，TSA 底物与抗原共价结合，不易被洗涤洗脱，且背景低，改善荧光二抗因非特异性结合导致的染色效果差。
7. 样本为小鼠，是否可以选择小鼠来源的一抗？
答：通常不建议采取这种方式，因为如果一抗来源于小鼠，那么二抗也需使用抗小鼠的二抗，这可能会与样本中本身存在的IgG发生交叉反应，从而导致非特异性结合。若必须使用与样本同种属来源的一抗，建议进行阴性对照实验，即在未添加一抗的情况下，仅加入二抗，以检测是否会产生非特异性信号。
8. 做多标时，指标/抗体顺序如何选择？
答：难以洗脱的抗体，摆在最后一轮，不然容易串色。兔鼠一抗交叉做。比较难做的指标放在前面几轮做。低表达靶标选择荧光强度高、抗淬灭性强的染料，并放在前几轮做。高表达靶标选择荧光强度适中的染料，避免信号饱和掩盖细节。若两种蛋白共表达，建议选择波长差异大的。
9. 实验操作过程需要避光吗？染好的片子可以保存多久？
答：Enklife TSA试剂盒的荧光染料具有优异的抗淬灭性能，无需刻意进行避光操作。但使用过程中也需避免暴露在太阳光下直射，及长时间曝光。染色玻片在4℃条件下通常可保存6至12个月。
10. 能否使用冰冻漂片进行TSA实验？
答：TSA试剂盒不适用于漂片。因为漂片厚度太厚，不利于试剂的渗透，且漂片在操作过程中形态容易发生改变，如卷曲，褶皱等。
11. 做石蜡切片 mIHC，抗体应该怎样选择？
答：尽量选用单克隆抗体，抗体应用选用 IHC /mIHC/ IHC-P，优先选用经过敲除验证的抗体。
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