何为荧光漂白？何为荧光淬灭？

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荧光漂白和荧光淬灭是导致荧光信号衰减的两个主要过程，虽然结果相似（荧光减弱或消失），但它们的机制、可逆性和影响因素有本质区别。

荧光漂白

• 机制：荧光分子在吸收光子跃迁到激发态后，处于高能量状态，化学性质活跃。在极少数情况下（小概率事件），它不会通过发射荧光回到基态，而是会与周围的氧气等物质发生不可逆的光化学反应（如氧化）。这会导致其发色基团的共轭结构被破坏，电子轨道改变，从而永久失去吸收和发射光子的能力。
• 比喻：像一个被“烧坏”的LED灯。在持续通电（光照）工作后，内部结构因过热或老化而损坏，再也无法发光。
• 关键因素： 激发光强度和照射时间（总光剂量）。光照越强、时间越长，漂白越严重。

荧光淬灭

• 机制：这是一个物理过程，主要有两种类型： 动态淬灭：淬灭剂分子（如碘离子、氧气）与处于激发态的荧光分子发生碰撞，使能量以热能等形式散失。 静态淬灭：荧光分子在基态时就与淬灭剂分子形成了非荧光的复合物，根本不会被激发。 FRET淬灭：一种特殊的、距离依赖的能量转移，供体分子的能量转移给受体分子，导致自身荧光减弱。
• 比喻：像一个正在发声的音叉（激发态分子）被手握住（淬灭）。音叉本身没坏，只是振动能量被吸收了，声音停止。手拿开后，敲击它还能再次发声（可逆）。
• 关键因素：淬灭剂的种类和浓度、温度（影响碰撞频率）、分子间距离（对FRET至关重要）。

如何区分

• 观察恢复性：停止照射并移动样品区域后，如果信号恢复，很可能是局部淬灭（如氧淬灭）；如果信号永久消失，则是漂白。
• 进行对照实验：去除或添加可能的淬灭剂（如除氧、添加淬灭剂），观察荧光变化。
• 分析衰减动力学：漂白通常遵循单指数衰减。

如何应对

• 对抗漂白：使用抗漂白封片剂、降低激发光强和曝光时间、使用更稳定的荧光蛋白/染料变体（例如Fluor488 vs FITC, Fluor555 vs Cy3）、进行图像后期处理。
• 对抗淬灭：排除淬灭剂（如除氧抽滤）、优化缓冲液成分、注意pH和离子浓度、在固定样品时选择合适的封片介质。

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