文献分享：基于多重免疫荧光技术评估肾移植活检中炎症浸润

一、研究背景

肾移植后的延迟移植肾功能（DGF）是肾脏移植后常见并发症，定义为移植后7天内需要透析，是慢性肾移植损伤的一个重要危险因素。而间质纤维化和肾小管萎缩（IFTA）是慢性肾损伤的典型表现。然而，并非所有DGF患者都会进展为IFTA，二者间的复杂关联尚未明确，核心瓶颈在于传统评估方法难以精准量化炎症浸润特征，无法早期识别IFTA进展的预测标志物。传统组织学评估依赖病理医师主观判断，准确性受经验影响大，且无法同时捕获多类免疫细胞的表型、密度及空间分布信息，制约了对炎症微环境与移植物预后关联的深入探究。《Quantitative assessment of inflammatory infiltrates in kidney transplant biopsies using multiplex tyramide signal amplification and deep learning》聚焦肾脏移植活检中炎症浸润的定量评估技术革新，旨在解决延迟移植肾功能患者间质纤维化和肾小管萎缩进展预测的临床难题，通过技术融合实现炎症浸润的精准量化分析。

二、核心技术

mTSA基于酪胺信号放大原理，通过辣根过氧化物酶催化酪胺分子氧化激活，使其在靶抗原邻近区域共价沉积大量荧光报告基团，信号放大倍数可达10-100倍，可高效检测低丰度抗原。研究设计了两套mTSA检测方法：第一套用于可视化毛细血管、T淋巴细胞、B淋巴细胞及巨噬细胞；第二套聚焦T辅助细胞和巨噬细胞亚群。突破传统免疫组化单张切片仅能标记1-2个靶点的局限，实现多细胞类型的同步原位标记。之后经多光谱成像，通过定制Python脚本将图像转换为人工明场全切片图像，兼顾成像灵敏度与病理医师的阅片习惯，且兼容福尔马林固定石蜡包埋样本，适配临床病理常规样本类型。

分析采用卷积神经网络（CNNs）构建细胞识别模型，其核心优势在于能自动提取图像中的特征信息，如细胞形态、染色强度、纹理特征，规避人工特征提取的局限性。模型基于现有免疫组化细胞检测框架优化，针对不同染色类型的炎症细胞设计专属识别算法，通过多层卷积、池化操作强化细胞特征与背景的区分度，最终实现对目标细胞的精准定位与计数。

三、结果分析

多重TSA实验验证

由于 mTSA 涉及多次抗原修复，不同抗体对重复热修复的耐受性存在差异。因此，研究人员利用福尔马林固定石蜡包埋的扁桃体组织，通过模拟 1 至 6 次煮沸循环，对 9 种目标抗体进行了梯度热修复耐受性测试。之后进行显色免疫组化评估各抗体在不同循环次数下的染色强度，最终确定了各抗体在 mTSA 实验中的最佳使用顺序，以确保所有靶点在多重染色过程中均能保持最佳的抗原亲和力与信号强度。

如果目标表位发生共定位，酪胺沉积可能会相互干扰。为了检测这种空间位阻抑制，研究使用扁桃体对照组织切片，并采用mTSA检测组合进行染色。将 mTSA 中的抗体表达与经过相同次数煮沸修复循环的单独染色切片进行比较。如上图结果，观察到单独染色切片与多重染色切片之间的染色模式未存在差异。

基于CNNs的IHC阳性细胞检测

为了应用最初为明场显微镜开发的现有卷积神经网络，研究将mTSA荧光图像转换为人工明场图像。生成的人工明场 IHC 全切片图像适用于由传统 IHC 全切片图像训练的卷积神经网络进行自动化分析。

不同细胞类型的相关性

在移植后 6 周的活检样本中，CD4?GATA3?细胞密度与 CD163?细胞密度之间观察到最强的相关性（图 A）。相比之下，CD4?Tbet?细胞密度与 CD163?细胞密度之间的相关性较弱（图 B）。当将细胞群限定为双阳性巨噬细胞（CD68?CD163?）时，其与 CD4?GATA3?细胞的斯皮尔曼相关系数为 0.65，与 CD4?Tbet?细胞的相关系数为 0.66（图 C、D）。且在分析中纳入被膜下区域并未改变上述结果。

IFTA与非IFTA患者之间炎症浸润的比较

在移植后 6 个月进展为 IFTA 的患者中，其移植后 6 周活检样本中的 CD163?细胞密度显著高于非 IFTA 的患者。因此CD163?巨噬细胞浸润可能是IFTA进展的潜在预测指标。CD68 和 CD4 在两组检测方法中均有使用。对 CD3?CD8?/CD3?CD8?细胞比例的评估显示，移植后 6 个月 IFTA 进展程度 < 10% 的患者，其细胞比例显著高于 IFTA≥10% 的患者。表明T细胞亚群比例失衡与移植物纤维化进展密切相关。

CD68?细胞与 CD3?、CD3?CD8?及 CD20?细胞之间，以及 CD163?细胞与 CD4?、CD4?Tbet?及 CD4?GATA3?细胞之间的平均最短距离在两组患者间无显著差异。表明这两项指标可能与短期IFTA进展无直接关联。

四、总结

该研究通过mTSA技术与深度学习的跨界融合，解决了传统方法定性为主、定量不足、多靶点检测受限等问题。mTSA技术保证了低丰度免疫细胞标志物的高灵敏度检测与多靶点同步成像，深度学习模型则实现了炎症细胞的自动化、标准化定量，规避了人工阅片的主观性，构建了肾脏移植活检炎症浸润的精准定量评估方法，不仅突破了传统病理评估的局限，还挖掘出具有临床价值的IFTA进展预测标志物，为肾移植术后的精准管理与预后改善提供了重要技术支撑与理论依据。

参考文献

Hermsen M, Volk V, Br?sen JH, Geijs DJ, Gwinner W, Kers J, Linmans J, Schaadt NS, Schmitz J, Steenbergen EJ, Swiderska-Chadaj Z, Smeets B, Hilbrands LB, Feuerhake F, van der Laak JAWM. Quantitative assessment of inflammatory infiltrates in kidney transplant biopsies using multiplex tyramide signal amplification and deep learning. Lab Invest. 2021 Aug;101(8):970-982. doi: 10.1038/s41374-021-00601-w. Epub 2021 May 18. PMID: 34006891; PMCID: PMC8292146.

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