mIHC多重免疫染色在肿瘤研究中的应用实例

肿瘤免疫微环境（TIME）是由肿瘤细胞、浸润免疫细胞、基质细胞、细胞因子及细胞外基质共同构成的复杂动态微生态系统，其细胞组分、空间分布及相互作用模式直接决定肿瘤增殖、侵袭、转移及免疫治疗应答效果。传统单一免疫组化、单色免疫荧光染色仅能检测单个生物标志物，无法还原TIME多细胞、多分子的协同调控特征，存在明显的检测局限性。mIHC多重免疫染色技术可在单张组织切片上同时定位、定量十余种乃至数十种蛋白标志物，精准解析各类免疫细胞的浸润密度、空间排布、功能状态及细胞间相互作用，已广泛应用于肿瘤微环境、空间蛋白组学、神经科学、病理分型等前沿研究，成为高分期刊的核心支撑技术。本文结合多篇研究实例，系统阐述多重免疫染色技术在肿瘤免疫微环境研究中的具体应用场景与临床价值。

非小细胞肺癌（NSCLC）的肿瘤巢区与基质区存在显著的免疫微环境异质性，这种差异直接塑造了免疫抑制微环境，是肺癌免疫逃逸、病情进展的关键诱因。免疫标志物的表达与空间分布，更是判断TIME抑制程度的核心依据。

Peng团队依托mIHC多重免疫荧光技术，针对性解析了NSCLC肿瘤巢、肿瘤基质两大区域中10种核心免疫标志物的表达特征与细胞互作关系。

研究结果清晰证实，肺癌微环境中存在多组关键免疫细胞互作体系：基质区CD20?B细胞与CD4?CD38?T细胞、中性粒细胞与FOXP3?调节性T细胞存在强关联；肿瘤内部CD8?T细胞与PD-L1?M2型巨噬细胞、PD-L1阳性细胞与CD8?T细胞的相互作用，直接影响抗肿瘤免疫应答。同时研究还发现，肿瘤CD133?干细胞样细胞与非PD-L1表达型M1巨噬细胞存在中度相关性，提示巨噬细胞可能参与介导CD8?T细胞耗竭过程。

这项研究借助mIHC的多靶点同步检测优势，首次完整勾勒出NSCLC的肿瘤免疫景观与细胞互作网络，为肺癌机制深挖、新型治疗靶点筛选提供了关键数据支撑。

临床肿瘤研究往往需要批量分析样本，传统染色技术操作繁琐、检测效率低，难以满足高通量研究需求。而mIHC多重免疫荧光+组织芯片（TMA）的组合方案，完美解决了这一难题。

本研究优化出两套标准化多重免疫荧光染色面板 IP1、IP2，分别针对支气管肺癌、乳腺癌组织芯片开展高通量多标志物同步标记，依托 Vectra 3 成像系统采集图像后搭配 inForm 软件完成多光谱图像解混、伪彩赋值，还可生成模拟 DAB 显色的病理视图，兼顾多指标同步检测精准度与常规病理判读习惯。

其中 IP1 面板可同步识别 TME 中 5 类核心细胞，结合 Ki67 核染色精准评估各类细胞增殖活性，通过 CK 与 CD117 蛋白共定位精准区分肿瘤细胞、肥大细胞不同亚群；IP2 面板聚焦普通 T 细胞、细胞毒性 T 细胞、巨噬细胞等核心免疫细胞，同时纳入 PD-1/PD-L1 免疫检查点同步检测，成功捕捉到乳腺癌样本中 PD-L1?CD68?巨噬细胞与 PD-1?T 细胞原位紧密共定位的关键特征。

该研究验证了 mIF 联合 TMA 技术的优势，可在单张组织原位系统性解析多类型肿瘤的微环境细胞分型、增殖功能状态与免疫细胞空间分子互作，为大规模临床样本肿瘤免疫微环境可视化研究提供了标准化、可落地的技术路径。

结直肠癌的发生发展与多种蛋白标志物异常表达密切相关，精准定位、定量检测各类标志物，是肿瘤分型、预后判断的重要基础。

Zhang等人针对结直肠癌组织开展mIHC多重染色实验，分别对乙状结肠癌、升结肠癌组织进行多靶点检测。实验通过HE染色、DAPI染色完成组织定位，再分别检测CD133、PD-L1、HER2、CD68四种核心蛋白的表达分布。

实验结果显示，四种蛋白在结直肠癌组织中表达位置、功能各不相同：CD133富集于癌细胞表面，与肿瘤干细胞特性相关；PD-L1表达于癌细胞及免疫细胞，主导免疫抑制；HER2定位于癌细胞膜，是靶向治疗核心标志物；CD68特异性标记肿瘤微环境中的巨噬细胞。

相较于传统单标染色，mIHC多色融合图像可在同一切片上清晰区分四种蛋白的空间分布与共表达特征，无光谱干扰、信号精准，为结直肠癌标志物研究、精准分型与疗效预判提供了可靠的技术支撑。

三级淋巴结构（TLS）是肿瘤微环境中关键的免疫功能结构，与肿瘤免疫应答、免疫治疗疗效密切相关，但其在胶质瘤中的空间分布、细胞组成与功能特征一直缺乏精准解析方案。

Cakmak团队利用多标志物组合mIHC技术，精准解析了胶质瘤中功能性TLS的空间结构与细胞组分。研究清晰呈现了血管周围微环境中CD20?B细胞、CD3?T细胞的分布规律，同时同步定位Col6A1、Col4等细胞外基质成分及αSMA、CD163等功能蛋白的表达位置，明确了免疫细胞与基质成分的空间关联。

研究核心发现：胶质瘤TLS聚集于Col6A1阳性的致密细胞外基质中，且紧邻血管组织；TLS内部富集增殖细胞、活化B细胞、树突状细胞等多种功能免疫细胞，具备完整的免疫应答能力。同时证实CD163?Col4?双阳性巨噬细胞可摄取基质成分，且该功能性TLS特异性分布于肿瘤内部，Col6A1仅在肿瘤区域表达，非肿瘤区域无表达。

该研究依托mIHC的高精度空间解析能力，首次明确了胶质瘤功能性TLS亚群的特征，为胶质瘤免疫分型、免疫机制研究开辟了新方向。

三阴性乳腺癌（TNBC）恶性程度高、预后差异大，精准筛选预后相关免疫标志物，对临床治疗方案制定至关重要。

Wang团队采用8色mIHC多重免疫荧光技术，对TNBC患者肿瘤组织切片进行检测。研究先通过H&E染色明确肿瘤组织、基质区域的宏观形态，为免疫细胞定位提供病理背景。随后依托高分辨率多色荧光系统，精准区分各类免疫细胞标志物信号，无交叉干扰。

实验成功鉴定出高间质CD68?PD-L1?巨噬细胞这一关键细胞亚群：通过CD68、PD-L1信号共定位精准识别靶细胞，同时借助Pan-CK信号排除肿瘤细胞干扰，确保检测结果精准可靠。后续临床数据分析证实，该特异性巨噬细胞亚群可作为三阴性乳腺癌患者预后改善的独立预测指标，为乳腺癌预后评估、免疫治疗疗效预判提供了全新的生物标志物。

从肺癌、乳腺癌、结直肠癌到胶质瘤，大量高分研究充分证实：mIHC多重免疫染色凭借单切片多靶点检测、空间定位精准、可定量分析、适配高通量样本的核心优势，完美弥补了传统染色技术的短板，能够深度解析肿瘤免疫微环境的细胞互作、标志物表达、空间结构特征，是当下肿瘤机制研究、标志物筛选、预后分析、免疫治疗研究的核心技术，也是冲刺高分SCI论文的关键助力。

专业mIHC多重免疫荧光TSA技术服务，EnkiLife一站式覆盖肿瘤微环境全流程实验，标准化抗体配比、光谱解混与空间定量分析，规避自实验信号干扰、染色不均等难题，高效助力高分SCI科研成果产出。

参考文献

[1] Peng H, Wu X, Zhong R, Yu T, Cai X, Liu J, Wen Y, Ao Y, Chen J, Li Y, He M, Li C, Zheng H, Chen Y, Pan Z, He J, Liang W. Profiling Tumor Immune Microenvironment of Non-Small Cell Lung Cancer Using Multiplex Immunofluorescence. Front Immunol. 2021 Nov 4;12:750046. doi: 10.3389/fimmu.2021.750046. PMID: 34804034; PMCID: PMC8600321.

[2] Mori H, Bolen J, Schuetter L, Massion P, Hoyt CC, VandenBerg S, Esserman L, Borowsky AD, Campbell MJ. Characterizing the Tumor Immune Microenvironment with Tyramide-Based Multiplex Immunofluorescence. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2020 Dec;25(4):417-432. doi: 10.1007/s10911-021-09479-2. Epub 2021 Feb 15. PMID: 33590360; PMCID: PMC7960613.

[3] Zhang W, Song ZJ, Zhang BY, Wang JL, Guo Q, Sun ZW, Tang H. Multiplex immunohistochemistry indicates biomarkers in colorectal cancer. Neoplasma. 2021 Nov;68(6):1272-1282. doi: 10.4149/neo_2021_210312N324. Epub 2021 Aug 30. PMID: 34459208.

[4] Cakmak P, Lun JH, Singh A, Macas J, Schupp J, Schuck J, Mahmoud Z, K?hler M, Starzetz T, Burger MC, Steidl E, Hasse LM, Hattingen E, Plate KH, Reiss Y, Imkeller K. Spatial immune profiling defines a subset of human gliomas with functional tertiary lymphoid structures. Immunity. 2025 Nov 11;58(11):2847-2863.e8. doi: 10.1016/j.immuni.2025.09.018. Epub 2025 Oct 21. PMID: 41125076.

[5] Wang J, Browne L, Slapetova I, Shang F, Lee K, Lynch J, Beretov J, Whan R, Graham PH, Millar EKA. Multiplexed immunofluorescence identifies high stromal CD68⁺PD-L1⁺ macrophages as a predictor of improved survival in triple negative breast cancer. Sci Rep. 2021 Nov 3;11(1):21608. doi: 10.1038/s41598-021-01116-6. PMID: 34732817; PMCID: PMC8566595.