小小凝聚体，掌控突触通讯：SNAP25 LLPS 机制文献解读

文献信息

	标题	SNAP25 undergoes phase separation to facilitate the assembly of the synaptic vesicle fusion machinery
	期刊	Cell Reports
	分区	中科院一区
	关键词	SNAP25, phase   separation, SNARE, exocytosis, condensate

一、研究背景

突触前精准、快速的神经递质释放高度依赖 SNARE 复合物介导的突触胞吐过程，Syntaxin-1、SNAP25、VAMP2 三种核心 SNARE 蛋白相互结合形成四螺旋反式 SNARE 复合体，拉近囊泡与细胞膜距离并启动膜融合进程，SNAP25 结构异常、基因突变会直接破坏突触信号传导，临床中大量发育性癫痫性脑病（DEE）患者体内均检出 SNAP25 杂合突变。既往显微成像研究已经观测到 SNAP25 与 Syntaxin-1 会在突触膜形成纳米尺度蛋白簇，这种聚集状态直接影响囊拴缚、锚定与启动释放，但长期没有研究解释蛋白成簇的分子驱动力；液液相分离（LLPS）作为细胞内无膜区室的组装方式，已被证实调控突触支架蛋白、突触结合蛋白 1 的空间聚集，而作为膜融合核心的 SNARE 蛋白是否依靠相分离实现局部富集始终是领域空白。Min Zhu、Yinghui Liu、Haijia Yu 团队于 2026 年在《Cell Reports》发表题为SNAP25 undergoes phase separation to facilitate the synaptic vesicle fusion machinery的研究，该文结合 SNAP25 独特分子结构 —— 两段 SNARE 基序之间存在大片内在无序连接区，且连接区半胱氨酸可发生棕榈酰化修饰，结合前人 Syntaxin-1 可增强 SNAP25 棕榈酰化的实验结论，提出完整科学假设：SNAP25 依靠无序连接区发生液液相分离，棕榈酰化修饰、Syntaxin-1 共同调控凝聚物形成，相分离产生的液滴可招募全部 SNARE 组分，促进三元复合体组装，DEE 致病突变会破坏相分离并阻断膜融合通路，以此完整填补 SNARE 蛋白聚集机制的研究缺口。

二、研究方法

该研究整合体外生化重构、活细胞光学检测、原代神经元模型、人工膜系统多重实验体系，实验材料涵盖原核表达纯化的野生型与系列突变 SNAP2、Syntaxin-1 胞内段、VAMP2 胞质结构域蛋白，同时构建多种荧光标记融合蛋白、光诱导相分离 OptoDroplet 质粒、SNAP25 与棕榈酰转移酶 ZDHHC17 靶向慢病毒干扰载体；体外实验搭建标准化相分离反应体系，利用荧光共聚焦、DIC 微分干涉成像观察液滴形态，借助沉降实验、浊度定量、圆二色谱、双溴甲烷色氨酸淬灭表征蛋白相分离与构象变化；细胞层面采用 HeLa 细胞敲低回补体系排除过表达干扰，依托 FRAP 荧光漂白恢复实验验证凝聚物液态动态特性，OptoDroplet 光控系统直观观测活细胞内蛋白共凝聚行为；体外膜重构部分构建平面支撑脂双层 SLB、巨型单层囊泡 GUV、小型囊泡 SUV 三种人工膜，模拟细胞膜与突触囊泡结构，还原膜表面蛋白聚集与囊泡招募过程；细胞功能实验使用大鼠原代海马神经元，通过免疫印迹验证蛋白表达量，共聚焦成像观察神经元内蛋白点状聚集；疾病机制部分构建 I67N、I192N 两种 DEE 相关突变蛋白，在 293T 细胞检测 SDS 耐受型功能性 SNARE 复合体生成量，所有实验均设置三次及以上生物学重复，采用 t 检验、单因素方差分析完成统计学差异判定。

三、结果分析

1. 体外与活细胞双重证实 SNAP25 具备液液相分离特性

研究首先通过蛋白无序预测工具 PrDOS 解析 SNAP25 氨基酸序列，整条蛋白中两段 SNARE 基序中间的连接区段存在大范围内在无序序列，这也是相分离蛋白的典型结构特征。体外重构体系中，纯化 EGFP 标记 SNAP25 在拥挤剂 PEG 生理模拟环境下自发形成球形液滴，延时成像捕捉到小液滴相互融合的动态画面，直观体现液态属性；梯度浓度、盐离子梯度实验绘制完整相图，证明蛋白浓度、渗透压、分子拥挤程度共同调控相分离发生，生理盐水浓度区间恰好满足凝聚物形成条件。为排除蛋白过表达带来的假聚集，研究构建 SNAP25 敲低 + 内源水平回补 HeLa 细胞，对照组仅表达游离 GFP 时细胞质荧光均匀弥散，而 GFP-SNAP25 细胞内出现大量明亮点状凝聚物；FRAP 漂白实验中凝聚物荧光可缓慢恢复，90 秒达到半数恢复水平，活细胞延时拍摄还能观察点状凝聚物互相融合，从细胞层面印证 SNAP25 在生理表达水平下仍能发生液相凝聚，内外两套体系相互佐证 SNAP25 固有相分离能力。

2. 无序连接区是 SNAP25 相分离的核心必需元件

研究者设计系列截短突变体拆解 SNAP25 功能区段，分别去除 N 端短肽、完整删除中间连接区、单独提取连接片段开展平行体外相分离实验。去除 N 端片段的蛋白仍能形成规整球形液滴，而缺失连接区的突变体仅产生无定形絮状沉淀，单独的连接片段甚至比全长蛋白更易形成大量液滴；沉降与浊度定量数据进一步量化差异，缺失连接区蛋白绝大部分留存于上清，几乎不形成可沉淀凝聚物。光诱导 OptoDroplet 系统同步验证该规律，蓝光刺激下除 ΔL 缺失连接突变体外，其余蛋白均可形成细胞内凝聚颗粒，单独连接片段产生的颗粒数量明显更多。最后在大鼠原代海马神经元中重复验证，野生 SNAP25 在神经元胞体与突触区域形成清晰荧光斑点，缺失连接区突变蛋白荧光完全均匀扩散，高分辨成像与己二醇溶解实验均证明点状结构为典型液相凝聚物，完整证明连接区是驱动 SNAP25 发生相分离的唯一核心结构。

3. 棕榈酰化修饰双向调控 SNAP25 相分离与膜锚定

连接区半胱氨酸是棕榈酰转移酶 ZDHHC17 的修饰位点，研究从细胞与体外突变两条路径验证修饰功能。细胞层面敲低 ZDHHC1 或加入棕榈酰化抑制剂 2-BP 后，HeLa 与海马神经元内 SNAP25 点状凝聚物大幅减少，蛋白脱离细胞膜、均匀分布于细胞质，说明棕榈酰化缺失直接破坏凝聚物形成与膜定位。研究者构建两类定点突变：C85A/C88A 双突变消除半胱氨酸修饰位点、C88L 单突变模拟棕榈酰化疏水效应，体外相分离体系中双突变液滴尺寸、数量显著下降，模拟修饰的 C88L 突变液滴更大更密集；平面脂双层 SLB 膜重构实验重现该趋势，只有具备棕榈酰化位点的蛋白才能在膜表面形成高密度蛋白簇，突变蛋白膜聚集能力显著减弱。原代神经元成像同样匹配体外结果，C88L 突变保留大量膜上荧光斑点，而双突变弥散分布，由此证实棕榈酰化通过提升连接区疏水性，一方面促进 SNAP25 液相凝聚，另一方面介导凝聚物锚定在突触细胞膜上。

4. Syntaxin-1 与 SNAP25 共凝聚并增强相分离效率

将等量 Syntaxin-1 胞质段与 SNAP25 混合后，双色荧光成像可见两种蛋白完全共定位在同一液滴内，液滴体积显著增大；浊度定量数值同步上升，FRAP 实验显示共凝聚物内部蛋白流动性下降，圆二色谱证明原本无序的 SNAP25 在结合 Syntaxin-1 后转变为 α 螺旋构象，说明二者互作引发蛋白结构折叠。梯度添加 Syntaxin-1 的实验呈现剂量依赖效应，蛋白沉淀中 SNAP25 占比随 Syntaxin-1 浓度持续升高；OptoDroplet 光控共表达体系中，Syntaxin-1 荧光完全渗入 SNAP25 光诱导凝聚颗粒，皮尔森相关系数证明二者高度共定位。人工平面脂双层体系模拟细胞膜环境，膜上固定 Syntaxin-1 后，SNAP25 会大量聚集形成更大共凝聚斑块，从溶液与膜两种环境证明 Syntaxin-1 可与 SNAP25 发生共相分离，同时放大凝聚规模。

5. SNAP25 凝聚物招募全部 SNARE 组分形成三元共凝集体

体外三色荧光标记实验中，Syntaxin-1、VAMP2 两种蛋白均可均匀分布在 SNAP25 液滴内部，沉降实验回收的凝聚沉淀可同时检出三种 SNARE 蛋白，证明凝聚物具备富集两种伴侣蛋白的能力。HeLa 细胞共表达三种荧光标记 SNARE 蛋白时，细胞内生成巨型融合凝聚体，FRAP 结果显示三元共凝集体内部蛋白流动性大幅降低，提示蛋白间广泛相互作用；体外等摩尔混合三种蛋白可直接形成大尺寸共凝聚液滴，配套体外 SNARE 组装实验证实相分离环境下功能性 SNARE 复合体生成量显著提升，明确 SNAP25 液滴作为分子支架，同时捕获两类配套 SNARE 蛋白，为四螺旋融合复合体的组装提供局部高浓度微环境。

6. SNAP25 凝聚物吸附细胞膜、介导突触囊泡锚定

研究采用 GUV 巨型囊泡模拟突触前细胞膜，带马来酰亚胺脂质的囊泡可结合 SNAP25，荧光成像清晰观察到 SNAP 凝聚物贴附、浸润囊泡表面，若移除马来酰亚胺膜结合位点，液滴无法吸附膜结构。当 GUV 膜预先锚定 Syntaxin-1 时，加入 SNAP25 会在膜表面形成大片共凝聚区域，再加入标记 VAMP 小型囊泡 SUV 后，所有囊泡都会集中富集在膜上 SNARE 共凝聚斑块内，无 SNAP25 时囊泡无法锚定在膜表面。对膜上三元凝聚物开展 FRAP 检测，蛋白流动性明显降低，印证膜、三类 SNARE 多重相互作用稳定囊拴缚状态，完整还原生理过程：膜锚定的 SNAP25 凝聚物搭建融合平台，捕捉携带 VAMP2 的突触囊泡，完成囊泡停靠步骤。

7. DEE 致病突变破坏相分离、抑制 SNARE 复合体组装

选取两种临床 DEE 致病突变 I67N、I192N 开展功能验证，同等体外条件下突变蛋白仅能形成微小、稀少液滴，沉降实验显示进入凝聚沉淀的蛋白量大幅下降；FRAP 曲线证明突变凝聚物内部分子运动受阻，延时液滴融合成像可见突变小液滴几乎无法融合生长，说明突变降低蛋白流动性、阻断液滴融合成熟过程。细胞层面共表达三类 SNARE 蛋白，野生型组可检出大量耐受 SDS 的功能性 SNARE 复合物，两种突变组复合体含量显著下调；三色荧光共转染细胞内，突变 SNAP25 无法与 Syntaxin-1、VAMP2 形成大型三元共凝集体。该组结果建立分子病理通路：致病突变损伤 SNAP25 液液相分离能力，破坏三元 SNARE 共凝聚平台，最终抑制膜融合机器组装，解释 DEE 患者突触释放受损的分子底层机制。

总结

本文围绕突触囊泡融合核心蛋白 SNAP25 展开系统研究，完整揭示棕榈酰化修饰调控的 SNAP25 液液相分离机制，阐明该过程在 SNARE 复合体组装、突触囊泡锚定及神经递质释放中的核心生理功能，并关联发育性癫痫性脑病的发病机理。研究首先通过体外生化与活细胞成像证实 SNAP25 能够发生液液相分离，蛋白两段 SNARE 基序之间的内在无序连接区是实现相分离的必需结构；连接区半胱氨酸棕榈酰化修饰可提升蛋白疏水性，双重促进凝聚体形成与细胞膜锚定，而 Syntaxin-1 可与 SNAP25 共凝聚，进一步放大相分离效应并诱导 SNAP25 构象转变，在膜表面搭建 t-SNARE 富集支架。SNAP25 凝聚体可同步招募 Syntaxin-1 与 VAMP2 形成三元 SNARE 共凝聚体，大幅提升功能性 SNARE 复合体的组装效率，人工膜重构实验证明膜结合的 SNAP25 凝聚体能够浸润膜界面、捕获含 VAMP2 的突触囊泡，解释神经元毫秒级同步递质释放依赖局部 SNARE 蛋白富集的分子基础。研究进一步发现两种 DEE 致病突变 I67N、I192N 会破坏 SNAP25 凝聚体流动性、阻断液滴融合，抑制三元共凝聚体与功能性 SNARE 复合体生成，从分子层面建立相分离缺陷与神经发育疾病的关联。文章客观说明现有局限，尚未解析 Munc18、Munc13 等关键调控蛋白对 SNAP25 凝聚体的调控作用，也缺乏体内动物实验佐证生理功能。整体研究填补了 SNARE 核心蛋白相分离调控突触胞吐的领域空白，提出无膜凝聚体调控快速神经元通讯的全新范式，拓展了突触前分子排布与神经递质释放机制的认知。

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