基因编辑一百问之如何设计sgRNA

sgRNA 由crRNA（向导序列，20 nt）+ tracrRNA 骨架组成；crRNA 的 20 bp 与靶 DNA 互补，下游需要 PAM 序列（NGG，SpCas9），Cas9 在 PAM 上游 34 bp 位置切割 DNA。

一、核心设计原则（SpCas9，最常用）

1. 靶点区域选择：

l 敲除基因：优先选编码区 CDS 前 1/3，避开最后 12 个外显子；避免内含子、UTR，防止剪接逃逸。

l 尽量避开外显子内含子交界、重复序列、高 GC 区。

不要选靠近起始密码子 ATG 但存在可变剪接的区域。

2. PAM 位点选择：

l SpCas9 识别 5′NGG3′，位于靶序列的3’端下游。

l sgRNA 的 20 nt 向导序列 = PAM 上游往前数 20 个碱基。

l 序列格式：[20nt向导] NGG

3. 转录起始位点：

l U6 启动子：要求 sgRNA第一个碱基为 G。如果靶点首位不是 G，可以额外加一个 G 在 5′端。

l T7 启动子：要求 5′端为 GG，体外转录用。

4. GC 含量：

l 推荐 40%60%；GC＞70% 或＜20%，切割活性显著下降。

5. 脱靶风险：

l 避免与基因组其他位点在 种子区（PAM 近端 10–12 bp） 完全匹配；全序列水平应避免 ≤3 个错配的位点，且错配应尽可能分布在 5' 端（远离 PAM）。

l 优先选择特异性得分高的靶点；sgRNA 的 3' 端（靠近 PAM，即种子区） 错配对切割活性的影响最大，1–2 个错配即可基本消除切割；而 5' 端（远离 PAM）的错配容忍度较高，是脱靶的主要风险区域。因此，评估脱靶时应重点关注非种子区（5' 端）错配的位点。

6. 靶点链：

l 正义链、反义链均可作为 sgRNA 模板，不影响切割，看 PAM 位置。

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