原代细胞直接分离自动物或人体组织，完整保留了源组织的原始生物学特征，是学界公认的体外研究细胞生理功能的“黄金标准”。但原代细胞本身存在诸多天然局限：极易衰老、传代扩增能力受限，不同批次间性状差异大，人源原代细胞更面临组织取材困难的难题。往往一次分离得到的细胞量不足以支撑全部实验，甚至仅够开展预实验；更换细胞批次后还需要重新摸索培养条件，常常让研究者焦头烂额、苦不堪言。

原代细胞永生化技术的核心价值，正在于能够同时兼顾“可长期稳定扩增”与“最  大 程度贴近原代细胞生理状态”两大优势。原代细胞永生化核心技术：通过基因修饰或体外培养调控，让原代细胞摆脱衰老凋亡的限制、实现长期增殖，同时最  大  程度保留原始细胞的固有生物学特性，是构建稳定细胞模型、开展规模化实验的关键手段。

细胞的有限寿命由10种及以上发挥显性作用的衰老基因共同调控，这些基因的产物对细胞周期进程发挥负调控作用（Goldstein et al., 1989; Sasaki et al., 1996）。这些基因中的一个或多个还可对端粒酶的表达起负调控作用（Holt et al., 1996; Greider and Blackburn, 1996; Smith and de Lange, 1997; Bryan and Reddel, 1997）。端粒酶负责端粒DNA的末端合成，缺少该酶时，端粒DNA会在细胞的有限生命周期中逐渐缩短，最终导致染色体DNA无法完成复制。端粒酶在生殖细胞中表达，在干细胞中活性中等，而在体细胞中不表达。

当衰老基因发生缺失和（或）突变，或是一个或多个癌基因出现过度表达或突变，且其作用效应超过了衰老基因的调控作用时，细胞就能脱离细胞周期的负调控，重新表达端粒酶，最终实现永生化。

目前学界认为永生化是一个多步骤过程，涉及一系列细胞周期调控基因（如 Rb 和 p53）失活。永生化本身并不意味着细胞会发展为生长控制异常和恶性化：许多永生化细胞系，如 3T3 细胞，仍保留细胞接触抑制性、细胞增殖的密度限制和停泊依赖性，且不具备致瘤性。但不可否认，细胞生长调控的某些层面必然出现了异常，进而导致基因组不稳定性升高。此外，多数永生化细胞系常会丧失分化能力。不过已有研究报道显示，经端粒酶诱导永生化的角质形成细胞（Dickson et al., 2000）和骨骼肌卫星细胞（Wootton et al., 2003），p53 活性并未消失，且完整保留了分化能力。

 

图1：部分靶基因已被用于通过基因操作手段实现细胞永生化。（Yamaguchi, Natsuki et al.2024）

病毒基因致永生化

目前已有多种病毒基因被应用于细胞永生化操作。人们早已发现SV40可用于制备永生化细胞，大T基因（LT）很可能在该过程中发挥核心作用（Mayne et al., 1996）。其他可诱导永生化的病毒基因还包括腺病毒E1a（Seigel, 1996）、人乳头瘤病毒（HPV）E6和E7（Peters et al., 1996; Le Poole et al., 1997），以及Epstein-Barr病毒（EBV；该体系常使用完整病毒）（Bolton and Spurr, 1996）。这类病毒基因多数通过抑制CIP1/WAF1/p21、Rb、p53和p16等基因的活性，解除上述基因对细胞周期进程的抑制作用从而发挥功能，这一过程既能够延长细胞寿命，也会削弱DNA监控机制，增加细胞发生进一步突变的概率。上述基因中目前已得到广泛应用的包括：EBV用于成淋巴细胞样细胞（Bolton and Spurr, 1996）；SV40 LT用于成纤维细胞（Mayne et al., 1996）、角质形成细胞（Steinberg, 1996）和内皮细胞（Punchard et al., 1996）等黏附细胞；hTERT则用于间充质干细胞及其他多种细胞。

端粒酶类TERT 转导致永生化致永生化。

hTERT（人端粒酶逆转录酶）诱导的细胞永生化是当前细胞生物学和再生医学中最安全、最常用的方法之一。它通过激活端粒酶维持染色体末端的完整性，从而绕过海弗里克极限，实现细胞的无限增殖。

人细胞的端粒酶激活，可通过表达编码 hTERT（端粒酶的催化亚基）的构建体诱导完成（Bodnar et al., 1998）。与通过表达病毒癌基因获得永生化的细胞相比，以此方法获得永生化的细胞保持更多正常细胞的特征（Jiang et al., 1999; Toouli et al., 2002）。

我们通过从技术机制，技术优势，适应细胞种类，以及技术的局限性等方面进行对比，协助您选择合适的实验方式用于您的实验。

1) SV40

v 分子机制：大 T 抗原通过 N 端 Rb 结合域结合并隔离 pRb 家族（pRb/p105、p107、p130），解除 E2F 抑制、驱动 S 期；C 端 p53 结合域使 p53 稳定化但功能失活（注意是 "结合灭活" 而非降解）；SV40 大 T 抗原直接结合并抑制 p53 和 Rb 蛋白，迫使细胞无视 DNA 损伤检查点进入分裂期（ Pipas J M et al.，2009）。

v 技术特点与优势：方法最经典、文献案例充分，方法高效，广谱适用。

v 适用细胞：长用于黏附类细胞，比如成纤维细胞、角质形成细胞、内皮细胞、上皮细胞等。

v 局限性：大 T 是强转化蛋白，直接灭活 p53/pRb，对研究这些通路的功能构成致命缺陷，同时易致基因组不稳定、染色体畸变；细胞表型（分化、药物敏感性）偏移明显；携带病毒蛋白需按生物安全要求管理。

2) 腺病毒 E1A（需协同的 "单臂" 方法）

v 分子机制：E1A 通过 CR1/CR2 结构域结合 pRb 家族释放 E2F，并经 p300/CBP 调节转录。关键缺陷是单用不灭活 p53，诱导 p53 依赖性凋亡 / 衰老，因此永生化几乎必须与 E1B-55K（降解 p53）或 hTERT 联用（King, Cason R et al.2018；Debbas, M, and E White.1993）。

v 技术特点与优势：在啮齿类细胞单独使用即可诱导一定增殖能力，是研究 Rb/E2F 通路与细胞周期的经典工具；与 E1B 联合（如 293 细胞系）成熟。

v 适用细胞：上皮细胞（Douglas JL et al.1994）

v 局限性：单独效率低、适用范围有限；E1A 仍是病毒转化蛋白，存在基因组不稳定与部分转化表型；一般不宜作为 "人正常细胞建系" 的  首  选。

 

 图2：展示了真核细胞中 HAdV-5 E1A 蛋白相互作用网络的示意图

3) HPV E6/E7（人上皮细胞的高效选择）

v 分子机制：双通路 + 端粒三管齐下——E7 使 pRb 家族蛋白失活释放 E2F，强制细胞进入 S 期（DNA 合成期），打破 G1 检查点；E6 结合并促进抑癌基因p53降解，阻断 DNA 损伤信号通路，使受损细胞逃过凋亡，继续存活增殖（zur Hausen H. 2002；Scheffner, M et al.1990）；同时E6 蛋白激活端粒酶（hTERT）表达（Liu, Xuefeng et al.2008），延长染色体末端，防止复制极限。因此 E6/E7 几乎 "一步到位" 覆盖 p53、pRb、端粒三大障碍，永生化成功率高。

v 技术特点与优势：使用慢病毒或逆转录病毒将 HPV16/18 的 E6/E7 基因整合入宿主基因组，感染率高，适用于难以转染的原代细胞，人上皮细胞（角质形成细胞、宫颈、口腔、乳腺、前列腺上皮等）建系效率高、流程成熟。

v 适用细胞：人上皮细胞最优，也适用于对成纤维细胞、角质形成细胞等。

v 局限性：高危型 E6/E7 是强致癌基因，恶性转化风险最高，可能出现锚定非依赖生长、裸鼠成瘤等表型；降解 p53 破坏 DNA 损伤应答，影响辐射 / 基因毒性药物实验；长期培养突变累积多，不适合需要 "接近原代表型" 的研究；非 HPV 感染相关疾病的模型构建中不适用。涉及致癌基因操作、生物安全要求高。

 图3：HPV E6/E7介导的细胞转化的示意图，以及细胞转化中仍存在的一些问题。（Vats, Arushi et al. 2021）

4) Epstein-Barr 病毒（B 细胞专用）

 Epstein-Barr 病毒（EBV）是最早被发现能够将正常人类细胞转化为无限增殖状态的病毒。该技术广泛用于构建淋巴细胞系（如 LCLs）和研究病毒致瘤机制。

v 分子机制：EBV 诱导永生化并非依赖单一基因，而是通过多个核抗原（EBNAs）和潜伏膜蛋白（LMPs）协同作用，EBNA2: 被视为“主开关”。它与宿主细胞的 RBP-Jkappa 蛋白结合，激活关键原癌基因（如 c-myc），驱动细胞进入 S 期、EBNA-LP（协同）、EBNA-1（维持附加体复制）、LMP-1（组成型激活 NF-κB，类似 CD40）、LMP-2A（模拟 BCR 信号维持存活）。结果是 B 细胞被激活并阻断终末分化，形成淋巴母细胞样细胞系（LCL）。（Zhao, B et al., 2006）

v 技术特点与优势：建立永生化 B 淋巴细胞系（LCL）的标准方法，流程成熟（从 PBMC 感染建立）；高保真：生成的细胞系（如 LCLs）保留了原始 B 细胞的表型特征，是免疫学研究的黄金模型、安全性相对较高: 相比于某些强致瘤病毒，EBV 在体外主要维持潜伏状态，对操作者的直接危害较小。

v 适用细胞：B 淋巴细胞、鼻咽上皮细胞等特定类型细胞转化

v 局限性：适用的细胞类型有限，转化效率低；EBV 是致瘤病毒（相关伯基特淋巴瘤 / 鼻咽癌），操作需生物安全防护。

图4：图解说明了 EBV 诱导的 B 细胞永生化过程中病毒干扰端粒维持的不同途径.（Kamranvar, Siamak A, and Maria G Masucci.2017）

5)  hTERT（最接近生理状态的现代 首   选）

v 分子机制：hTERT 为端粒酶催化亚基，过表达重建端粒酶活性、维持端粒长度，绕过Hayflick极限。。

v 技术特点与优势：不灭活 p53/pRb、不引入病毒癌基因，对细胞遗传背景扰动最小，致瘤 / 转化风险最低，是公认最 "干净"的永生化方式（Yamaguchi, Natsuki et al.2024）；能较好保留原代表型、分化潜能与基因表达特征；适用范围广（成纤维、间充质干细胞、内皮细胞等单独即有效）；也常作为评估 "该细胞株是否真正永生化、是否保持正常性" 的金标准对照。

v 适用细胞；成纤维、间充质、角质形成细胞、成肌细胞、神经元等。

v 局限性：长期培养仍有低概率核型变化以及表观漂移；

 

                          

 

  图5：hTERT永生化细胞的特征

 

 

 

图6：端粒酶结构示意图（Kamranvar, Siamak A, and Maria G Masucci.2017）

结论

SV40、腺病毒E1a、人乳头瘤病毒（HPV）E6和E7、Epstein-Barr病毒、hTERT这五种细胞永生化策略，本质上是通过不同机制绕过细胞衰老的两道核心障碍：① p53/pRb介导的增殖性衰老（早衰）通路，② 端粒缩短介导的复制性衰老（Hayflick极限）通路。

 在实际研究中，细胞永生化技术的核心价值，在于能够同时兼顾“可长期稳定扩增”与“最  大  程度贴近原代细胞生理状态”两大优势。武汉恩玑提供成熟的细胞永生化与稳定细胞系整体解决方案，已建立起覆盖多种细胞类型的完善永生化技术体系，可根据细胞来源和研究目的适配对应的永生化基因，涵盖SV40 T、hTERT、HPV16 E6/E7、CDK4、c-Myc及p53等，可满足不同细胞种类的研究需求。

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