文献分析：mIF解析 TNBC 新辅助化疗后的免疫微环境

一、研究背景

三阴性乳腺癌（TNBC）因雌激素受体、孕激素受体与HER2均呈阴性，长期以来缺乏精准治疗靶点，虽只占乳腺癌总发病率的10%–15%，却以侵袭性强、早期复发率高、预后差而著称。然而正是这种"冷肿瘤中的异类"，比其他乳腺癌亚型展现出更高的免疫原性——肿瘤突变负荷高、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）丰富，使其成为免疫检查点抑制剂最有可能奏效的乳腺癌亚型。新辅助化疗（NAC）是早期高危TNBC的标准治疗路径，能否达到病理完全缓解（pCR）直接关系到患者的长期生存；TILs水平也早已被反复证实与pCR率和预后正相关。但临床长期存在一个令人困惑的悖论：并非所有高TIL的TNBC患者都能从NAC中获益，也并非所有低TIL患者都注定残留病灶——同样数量的淋巴细胞涌入肿瘤微环境，结局却可能天差地别。Park 等人 2025 年发表在《Breast Cancer Research》的题为Spatial analysis of tumor immune microenvironment of TNBC with different neoadjuvant chemotherapy outcomes using multiplex Immunofluorescence的研究，正是瞄准这一现实问题，多重免疫荧光技术可以在原位同时标记多种免疫标志物，不仅可以统计各类免疫细胞的数量，还能够捕捉免疫细胞与肿瘤细胞之间的空间位置关系，本研究利用治疗前的穿刺活检样本，跳出仅统计细胞丰度的传统思路，同时分析免疫细胞组成、空间邻近交互关系，尝试解析相同 TIL 水平下疗效差异背后的肿瘤免疫微环境机制，为三阴性乳腺癌新辅助化疗的患者分层挖掘潜在的免疫标志物。

二、研究方法

该研究回顾筛选 160 例 II?III 期接受新辅助化疗的三阴性乳腺癌患者，最终获得 16 例患者治疗前未接受过治疗的穿刺活检标本，收集患者完整临床病理信息，依据国际 TIL 工作组标准评估肿瘤浸润淋巴细胞水平，将患者划分为高 TIL 组与低 TIL 组，同时完成 PDL1 的 CPS 评分、肿瘤基质比值等病理指标检测；研究采用 Opal 多重免疫荧光染色，标记 CD8、CD4、FOXP3、CD20、CK 标志物，借助 Vectra Polaris 全切片扫描和 inForm 图像分析软件，划分肿瘤区域与基质区域两大感兴趣区，完成上百万细胞的单细胞水平识别、计数，提取每一个细胞的坐标信息，计算免疫细胞和肿瘤细胞之间的细胞?细胞距离，把相距 15μm 以内判定为存在直接细胞交互，使用核密度估计绘制距离分布，区分 pCR 和非 pCR、高 TIL 和低 TIL 亚组对比免疫细胞的组分占比、空间邻近特征与细胞配对组合，采用 Wilcoxon 秩和检验、卡方检验完成组间统计学比较，多角度解析肿瘤免疫微环境的细胞组成与空间模式。

三、研究结果与重点图表分析

这组组织学图像直观展现高 TIL 背景下，新辅助化疗疗效截然不同的两类样本在免疫细胞构成上的肉眼可辨差异。左侧这例患者在接受新辅助化疗后肿瘤被彻底清除（pCR），H&E 切片可以看到大量淋巴细胞浸润，对应的多重荧光视野里，细胞毒性 CD8?T 细胞以及 CD20?B 细胞大量出现在肿瘤细胞周边，抗肿瘤效应免疫细胞紧紧贴近肿瘤，构建起对抗肿瘤细胞的免疫防线。与之形成鲜明对比的是同样属于高 TIL、但是化疗之后仍存在残留病灶的右侧样本，组织切片同样拥有丰富淋巴细胞浸润，但是荧光成像下占据主导的是 CD4?以及 FOXP3?调节性 T 细胞这类免疫抑制细胞，杀伤性的 CD8?、CD20?细胞占比明显变少。这组对照很好地解释了临床的矛盾现象：仅仅依靠 H&E 切片评估 TIL 的多少是不够的，即便整体淋巴细胞数量很高，如果浸润的免疫细胞以抑制性亚群为主，患者依旧很难从新辅助化疗获益，提示免疫细胞的亚群类型，是解读肿瘤免疫状态不可缺少的一环，为后续大样本量化分析提供直观的病理依据。

通过饼图与柱状量化统计，把样本划分为全部、高 TIL、低 TIL 三个层级，分别在基质、肿瘤两大解剖区域对比 pCR 与非 pCR 患者的免疫细胞亚群占比。数据显示，不论病灶总淋巴细胞浸润水平高低，达到病理完全缓解的患者，在基质和肿瘤区域内，CD20?B 细胞、CD8?细胞毒性 T 细胞的占比都显著更高。与之相反，未达到病理完全缓解的样本中 CD4?细胞占据免疫细胞的绝对主体，尤其肿瘤区域内，代表免疫抑制的 CD4?FOXP3?调节 T 细胞比例大幅升高。在高 TIL 亚组当中，这种组分差异更加突出，非 pCR 患者的肿瘤病灶内部聚集大量调节性 T 细胞，基质区域却没有出现该现象，提示抑制性 T 细胞向肿瘤实质内部浸润，是削弱抗肿瘤应答的关键事件。而在低 TIL 亚组，实现 pCR 的样本依靠的主要是 CD8?T 细胞占比提升，B 细胞占比并不突出。这些结果揭示，新辅助化疗的疗效并不单纯由 TIL 总数量决定，免疫细胞内部的组分格局更为关键：高 TIL 的有利局面，需要 B 细胞与细胞毒性 T 细胞共同富集；而低 TIL 环境下，CD8?T 细胞的占比提升依旧有机会帮助患者实现病理完全缓解。

核密度曲线刻画不同免疫细胞距离最近肿瘤细胞的距离分布，把细胞的远近关系转化为概率分布，进一步挖掘细胞数量之外的空间生物学信息。对比不同疗效样本可以发现，无论 TIL 高低，pCR 患者中的 CD20?B 细胞、CD8?T 细胞都倾向于靠近肿瘤细胞，细胞和肿瘤的中位距离显著缩短，意味着效应免疫细胞可以近距离接触肿瘤细胞发挥杀伤功能。反观没有达到 pCR 的高 TIL 患者，CD4?FOXP3?调节 T 细胞反而紧紧聚集在肿瘤细胞周围，免疫抑制细胞直接和肿瘤细胞发生近距离交互，营造局部免疫抑制微环境。有趣的是在低 TIL 样本中，调节 T 细胞并没有表现出向肿瘤靠近的特征，此时能否取得好疗效主要取决于 CD8?T 细胞能否贴近肿瘤。当横向对比高 TIL 和低 TIL 样本时可以发现，pCR 患者中 CD20?、CD8?细胞的空间分布模式在高、低 TIL 组十分接近，二者的中位距离差距很小，说明只要效应免疫细胞可以抵达肿瘤周边，即便整体淋巴细胞浸润水平有限，依旧可以产生有效的抗肿瘤应答。这些数据有力证明，空间位置信息拥有独立于细胞计数的预测价值，不能只看有多少免疫细胞，更要看这些免疫细胞有没有走到肿瘤细胞的身边。

研究将距离肿瘤细胞 15μm 以内，判定为具备直接相互作用的细胞群体，堆叠柱状图统计这部分紧邻肿瘤的免疫细胞的亚群构成。对于整体样本，pCR 样本靠近肿瘤细胞的群体里面 CD8?与 CD20?细胞占比显著更高。分层之后可以看到，高 TIL 的 pCR 样本中 B 细胞占比非常突出，而低 TIL 的 pCR 样本，CD8?T 细胞成为占比最高的效应免疫细胞。在高 TIL 但未实现 pCR 的样本，紧邻肿瘤的细胞群体里调节性 T 细胞比例明显抬升。这一结果进一步完善了之前的距离分析，说明不同 TIL 背景下，介导新辅助化疗获益的核心免疫细胞存在区别：高 TIL 环境依赖 B 细胞与 T 细胞协同；低 TIL 环境，细胞毒性 CD8?T 细胞承担主要抗肿瘤功能。

热图展示样本内部相距 15μm 以内的免疫细胞?免疫细胞配对的构成比例，颜色深浅代表该类细胞配对的占比高低。样本注释同时标注患者的 pCR 状态、TIL 高低、PDL1 状态。CD4?CD4 配对是所有样本中出现频率最高的细胞组合；pCR 患者整体拥有更加丰富多元的免疫细胞配对类型。高 TIL 且实现 pCR 的样本，CD20?CD20、CD20?CD4 配对的占比明显升高，反映 B 细胞和其他淋巴细胞发生频繁局部互作，提示 B?T 细胞之间的协同交互是高 TIL 样本取得良好疗效的重要基础。反观非 pCR 患者，细胞配对类型相对单一，缺少 B 细胞参与的免疫细胞组合。低 TIL 的 pCR 样本，则更多出现包含 CD8?T 细胞的各类配对。这组空间配对分析，从细胞互作的角度解释了适应性免疫的协同机制，B 细胞并非只是旁观者，它和 T 细胞的局部近距离协作，是高 TIL 三阴性乳腺癌对新辅助化疗产生应答的重要条件。

四、研究总结

该研究借助多重免疫荧光的空间分析技术，直面临床中 TIL 标志物的局限性，跳出单纯统计免疫细胞数量的传统评估思路，同时兼顾免疫细胞亚群组分与细胞之间的空间交互信息。研究证实，三阴性乳腺癌新辅助化疗能否实现病理完全缓解，不只是由整体淋巴细胞浸润水平决定：高 TIL 条件下，CD20?B 细胞与 CD8?T 细胞共同富集、并且能够贴近肿瘤细胞，B?T 细胞近距离协同互作，是实现良好应答的关键，而肿瘤实质内富集的 CD4?FOXP3?调节 T 细胞会削弱治疗效果；低 TIL 条件下，CD8?T 细胞靠近肿瘤细胞，依旧可以驱动 pCR 发生。该研究揭示免疫细胞亚群类型、免疫细胞与肿瘤细胞的空间邻近关系、免疫细胞之间的局部配对互作，都是解读三阴性乳腺癌肿瘤免疫微环境的重要维度。但本研究样本数量较少，为回顾性单中心研究，没有纳入基因组、分子亚型数据，活检标本也难以完整反映整个肿瘤的全部免疫微环境，后续需要更大规模的前瞻性队列对结论进行外部验证。这项工作为三阴性乳腺癌新辅助化疗疗效预测提供新的思考，提示除 TIL 计数之外，免疫细胞亚群比例与空间特征有潜力开发成为新辅助化疗的辅助预测标志物。