单细胞视角：NSCLC 脑转移 ICI 应答的关键免疫细胞揭秘

一、研究背景

脑转移（BrM）是晚期非小细胞肺癌（NSCLC）最严重的并发症之一，患者预后极差，中位生存期短。随着NSCLC诊疗水平的不断提升，患者生存期延长，脑转移的发生率也逐年升高，成为制约患者生存质量的关键因素。免疫检查点抑制剂（ICIs）的问世为NSCLC脑转移患者带来了新的治疗希望，但临床实践中发现，ICIs在该人群中的疗效异质性显著，颅内客观控制率仅为16.4%-52.5%，仅少数患者能达到完全应答，多数患者无法从中获益。由于脑转移灶具有固有异质性，其基因组和转录组特征与颅外肿瘤存在明显差异，颅外肿瘤标志物难以有效预测颅内对ICIs的应答，而脑转移灶活检具有较高的手术风险和技术难度，临床应用受限。脑脊液（CSF）作为一种微创的液体活检样本，能够精准反映脑转移微环境的免疫状态，成为评估颅内免疫应答的理想载体。基于此，Li Y-S等人通过多种先进技术手段，系统探究NSCLC脑转移患者ICIs治疗前后脑脊液和脑转移灶的免疫细胞特征，明确与ICIs颅内应答相关的关键细胞亚群及调控机制，为临床精准筛选ICIs获益患者、优化治疗策略提供重要的理论支撑。

二、研究方法

该研究采用多技术、多队列的严谨研究设计，前瞻性纳入计划接受ICIs治疗的NSCLC脑转移患者，核心收集了20例患者ICIs治疗前及治疗期间的脑脊液样本、4例患者的脑转移灶组织样本，并整合了16例来自公共数据库（GEO）的脑转移灶单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，构建了研究的核心数据集。为确保研究结果的可靠性和可重复性，研究同时收集了31例脑脊液样本用于蛋白质组学分析、25例脑转移灶组织样本用于多色免疫组化（mIHC/IF）验证、8例脑脊液样本用于流式细胞术验证，形成了多维度的验证体系。研究核心采用scRNA-seq技术解析脑脊液和脑转移灶的免疫细胞亚群组成，结合PAGA分析、CellChat软件等工具，分析细胞发育轨迹、细胞间通讯关系及细胞功能，同时按ICIs治疗疗效将样本分为确认应答组（CR，无需脑放疗即有效）、潜在应答组（PR，需联合脑放疗才有效）、无应答组（NR，治疗后无应答或疾病进展）及未接受ICIs治疗的对照组，通过组间对比分析，明确与ICIs颅内应答相关的关键免疫特征。

该研究采用多技术、多队列的研究设计，选取计划进行 ICIs 治疗的 NSCLC 脑转移患者为研究对象，收集了20例患者ICIs治疗前及治疗期间的脑脊液样本，4例患者的脑转移灶组织样本，并整合了16例来自公共数据库的脑转移灶单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，构建了研究的核心数据集。同时，为确保研究结果的可靠性和可重复性，还收集了31例脑脊液样本用于蛋白质组学分析，25例脑转移灶组织样本用于多色免疫组化（mIHC/IF）验证，8例脑脊液样本用于流式细胞术验证，形成了多维度的验证体系。

研究核心采用scRNA-seq技术，对脑脊液和脑转移灶样本进行单细胞转录组分析，经过质量控制、数据标准化、批次效应去除、降维分析和无监督聚类后，结合已知的细胞标志物基因，鉴定免疫细胞亚群；通过PAGA分析、RNA velocity分析等方法解析细胞发育轨迹和状态转换，利用CellChat软件预测细胞间的通讯关系，借助AUCell、GSEA等分析工具评估细胞功能和通路活性。同时，通过流式细胞术验证关键免疫细胞亚群的存在及功能特征，利用mIHC/IF检测脑转移灶中关键细胞亚群的丰度，通过蛋白质组学分析验证关键通路的激活状态，并整合多个公共数据集，进一步拓展研究结论的普适性。研究根据患者的ICIs治疗状态和疗效，将样本分为确认应答组（CR，无需脑放疗即达到有效应答）、潜在应答组（PR，需联合脑放疗才能达到有效应答）和无应答组（NR，治疗后无应答或疾病进展），同时设置未接受ICIs治疗的样本作为对照，通过组间对比分析，明确与ICIs颅内应答相关的关键免疫特征。

三、结果分析

1、ICI治疗下NSCLC BrM的单细胞谱分析

研究对收集的脑脊液和脑转移灶样本进行scRNA-seq分析，保留了100051个高质量单细胞的转录组数据用于后续分析，成功鉴定出11种主要的免疫细胞类型，包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、自然杀伤细胞等，构建了整合ICIs治疗信息的精细免疫细胞图谱。散点图（t-SNE可视化）清晰呈现了所有免疫细胞的分布特征，直观展现了脑脊液中免疫细胞的多样性，其中CD4+T细胞是脑脊液中最丰富的免疫细胞类型。分组散点图显示，CR组治疗前巨噬细胞数量显著增多，CD4+T细胞及B细胞数量相对减少，而ICIs治疗后，患者脑脊液中CD8+T细胞的比例较治疗前明显升高，且不同应答组之间T细胞密度分布差异显著，为后续深入分析T细胞亚群与ICIs应答的关联奠定了坚实基础。进一步细分聚类后，研究鉴定出46种精细的免疫细胞亚群，同时结合应答组与无应答组患者ICIs治疗前后的脑部MRI影像，直观印证了两组患者的治疗效果差异，让整个研究逻辑更加完整。

2、CD4_Trm_CXCR6细胞是ICIs颅内应答的关键关联亚群

CD4+T细胞作为免疫系统的核心调控细胞，其亚群组成和功能状态与ICIs应答密切相关，研究将其进一步分为9个亚群，通过组间对比发现：在 ICI 治疗前的无应答患者（NR?pre）中，CD4? T 细胞主要由初始 T 细胞（CD4_Tn_CCR7）和记忆 T 细胞（CD4_Tm_Nos）构成；而在治疗前的确认应答患者（CR?pre）中，组织驻留记忆 T 细胞亚群（CD4_Trm_CXCR6）的比例显著高于 NR?pre 组。与 NR?pre 组相比，潜在应答患者治疗前（PR?pre）及无应答患者治疗后（NR?post）的 CD4? T 细胞亚群分布模式与 CR?pre 组更为相似，均表现为 CD4_Trm_CXCR6 亚群的高占比。独立验证队列的蛋白质组学结果显示，CD4_Trm_CXCR6 的特征蛋白（如 CXCL13、TIM?3）在 CR?pre 患者脑脊液中呈高表达；通过相对秩富集算法对蛋白表达进行量化分析，进一步证实 CR?pre 组中 CD4_Trm_CXCR6 细胞丰度显著高于 NR?pre 组。上述结果表明，CD4_Trm_CXCR6 亚群与 NSCLC 脑转移患者的 ICI 治疗应答呈显著正相关。

蛋白质组学验证结果显示， CR治疗前脑脊液中，CD4_Trm_CXCR6 细胞的特征蛋白（如 CXCL13、TIM?3）呈高表达，热图清晰展示了各组间蛋白表达差异。研究采用自定义相对秩富集算法对特征蛋白进行评分并估算细胞丰度，结果表明 CR 组治疗前 CD4_Trm_CXCR6 细胞丰度显著高于NR，差异具有统计学意义。PAGA 分析进一步提示，CR 组中 CD4_Tm_Nos 与 CD4_Trm_CXCR6 细胞间连接性更强，提示二者存在密切的功能协同，可共同参与抗肿瘤免疫应答的调控。

细胞间通讯分析显示，CR 组整体免疫细胞互作及 CD4?T 细胞特异性通讯强度均显著高于 NR 组；其中 CD86?CD28 共刺激信号在 CR 组、潜在应答组（PR）治疗前及 NR 组治疗后均呈明显富集，可有效促进 T 细胞活化与增殖。CD6?ALCAM 通路则仅在 CR 组与 PR 治疗前显著激活，且 CD6 在 CD4_Trm_CXCR6 细胞中高表达。该细胞亚群同时高表达组织驻留记忆、Th1 及细胞毒性相关基因，以及多种细胞因子与耗竭相关基因；流式细胞术进一步证实其 PD?1 与 IFN?γ 表达水平较高，提示该细胞虽处于部分耗竭状态，但仍具备较强的免疫活性。

3、脑脊液与脑转移灶患者中CD4+PDCD1+CXCR6+ T细胞的功能一致性

研究进一步整合20例NSCLC脑转移灶的scRNA-seq数据，深入探究脑转移灶中与ICIs应答相关的耗竭T细胞（Tex）亚群，最终鉴定出3种Tex细胞亚群，其中脑转移灶中的CD4_Tex_CXCR6细胞与脑脊液中的CD4_Trm_CXCR6细胞具有高度相似的转录组特征，均高表达PDCD1、CXCR6、CXCL13和PRDM1等基因，提示二者的功能具有高度一致性。

合并脑脊液和脑转移灶CD4+T细胞的散点图显示，两类细胞在维度约简空间中高度重叠，点图量化分析进一步证实，CD4_Tex_CXCR6细胞与脑脊液中CD4_Trm_CXCR6细胞的基因表达谱高度相关，为脑脊液作为脑转移灶免疫微环境的替代样本提供了重要依据。功能分析显示，CD4_Tex_CXCR6细胞的最强外向信号由CD6介导，这与脑脊液中CD4_Trm_CXCR6细胞的信号特征完全一致，且CD40信号在CR组治疗前的脑脊液CD4+T细胞中显著上调，提示CD40信号可能参与调控该细胞亚群的功能。

细胞丰度相关性分析表明，该细胞亚群的丰度与活化淋巴细胞（如CD8+T细胞、B细胞）呈正相关，与未成熟淋巴细胞及免疫抑制性髓系细胞呈负相关；配体-受体相互作用分析显示，其可通过分泌CXCL13招募活化免疫细胞，且仅脑转移灶中的该细胞亚群表达抗肿瘤细胞因子IL-21，共同证实其在连接脑脊液与脑转移灶免疫微环境、调控抗肿瘤免疫应答中的关键作用，二者可统一定义为CD4+PDCD1+CXCR6+ T细胞。

4、CD4+PDCD1+CXCR6+ T细胞的预测价值与分布特征

为验证CD4+PDCD1+CXCR6+ T细胞的临床预测价值，研究通过mIHC/IF检测了脑转移灶组织中该细胞亚群的丰度，结果显示，CR组治疗前的脑转移灶中，CD4+PDCD1+CXCR6+ T细胞的数量显著多于NR组，而其他PD-1阳性细胞亚群（如CD4+PDCD1+CXCR6-、CD8+PDCD1+）在各组间均无显著差异，证实其为ICIs颅内应答的特异性预测标志物。代表性的mIHC染色图像及柱状图，直观呈现了该细胞亚群在不同应答组中的富集特征及组间差异，进一步佐证了其预测价值。

整合多个公共数据集分析发现，CD4+PDCD1+CXCR6+ T细胞在外周血中几乎不存在，在正常肺组织中相对稀少，而在原发性肺癌组织和脑转移灶中丰度显著升高，体现出明显的肿瘤特异性，也解释了为何外周血生物标志物难以预测ICIs的颅内应答。进一步分析显示，CD4+PDCD1+ T细胞可明确分为CXCR6+和CXCR6-两个亚群，其中CXCR6+亚群高表达IFNG、PRF1等细胞毒性相关基因，且ICIs治疗后，应答者原发性肺癌组织中该亚群的TCR克隆扩增显著强于无应答者，提示CXCR6可作为定义免疫治疗应答性CD4+T细胞亚群的更精准标志物。

5、树突状细胞与CD4+PDCD1+CXCR6+ T细胞的协同作用机制

抗原呈递细胞（APCs）在激活T细胞免疫应答中发挥关键作用，研究发现，CD4_Tex_CXCR6细胞接收的最强信号来自MHC-II通路，而cDCs、单核细胞等APCs是该信号的主要来源，网络可视化图清晰呈现了APCs与CD4_Tex_CXCR6细胞的密切通讯关系。进一步分析显示，CR组脑脊液中CD4+T细胞接收的来自APCs（尤其是cDCs）的MHC-II信号，显著多于NR组，证实APCs的抗原呈递功能与ICIs应答密切相关。

功能分析显示，CR组治疗前的APCs具有更高的抗原加工和呈递功能评分，蛋白质组学分析也证实，CR组治疗前的脑脊液中，与MHC-II介导的抗原呈递相关的蛋白显著富集；脑脊液中的cDCs主要分为cDC1、cDC2和migDC三个亚群，CytoTRACE分析显示，CR组的cDC2和migDC具有更高的细胞干性，增殖分化潜能更强，能够持续激活T细胞免疫应答。而NR组的cDC2高表达AREG、VSIG4等免疫抑制相关基因，migDC高表达CD274等免疫抑制基因，免疫抑制功能较强；CR组的migDC高表达LAMP3蛋白，处于早期阶段，免疫抑制功能较弱，更有利于招募和激活T细胞。

cDCs的发育轨迹分析显示，cDC2可向migDC分化，CR组中该分化过程富集炎症、免疫活化相关基因，能够促进免疫应答启动；而NR组分化过程富集与免疫无关的基因，无法有效激活T细胞。此外，IL1B-IL1R2炎症信号通路仅在CR组中显著富集，进一步佐证了应答组脑脊液中活跃的促炎微环境，为ICIs应答提供了有利条件。

6、应答组脑脊液的促炎激活特征与单核细胞亚群作用

蛋白质组学通路富集分析显示，CR组治疗前的脑脊液中，肿瘤坏死因子、NF-κB等促炎相关通路显著富集，提示该细胞微环境处于活跃的促炎状态，能够有效促进免疫细胞活化，增强ICIs治疗效果。应答组脑脊液中的单核细胞具有更高的炎症活性，其中Mono_SELL亚群在CR组治疗前及NR组治疗后显著富集，该亚群高表达SELL、CFP等与免疫治疗应答相关的基因，以往研究已证实，这类单核细胞可作为原发性NSCLC患者免疫治疗应答的预测因子，本研究进一步拓展了其临床意义。

单核细胞-巨噬细胞的发育轨迹分析显示，Mono_COLEC12是单核细胞的分化起点，可向Mono_SELL细胞和巨噬细胞两个方向分化，提示Mono_SELL代表了一种独立于巨噬细胞的分化方向，且与ICIs应答密切相关。Mono_SELL细胞富集迁移、趋化及细胞因子产生相关的基因，能够招募和激活其他免疫细胞，且其激活蛋白1相关转录因子网络活性较高，可调控免疫细胞活化和细胞因子分泌，进一步参与促炎反应和免疫激活。

四、结论与展望

该研究通过scRNA-seq、蛋白质组学、mIHC/IF等多种技术手段，结合多队列验证和公共数据集整合，系统绘制了NSCLC脑转移患者ICIs治疗前后脑脊液和脑转移灶的免疫细胞全景图谱，明确CD4+PDCD1+CXCR6+ T细胞是ICIs颅内应答的关键预测因子。该细胞亚群在应答组治疗前的脑脊液和脑转移灶中均显著富集，具有高度相似的转录组和功能特征，能够与cDCs协同作用，通过激活共刺激信号、招募活化免疫细胞等机制，促进抗肿瘤免疫应答；应答组脑脊液中存在活跃的促炎微环境，Mono_SELL单核细胞亚群可作为ICIs应答预测的补充标志物。

该研究的临床意义显著：一方面，脑脊液中的CD4+PDCD1+CXCR6+ T细胞可作为微创、可靠的生物标志物，用于筛选ICIs治疗获益的NSCLC脑转移患者，避免无效治疗带来的不良反应和医疗资源浪费，为临床精准治疗提供指导；另一方面，该细胞亚群及其相关的CD6-ALCAM、MHC-II等信号通路，以及Mono_SELL单核细胞亚群，可作为潜在的治疗靶点，为优化ICIs联合治疗策略提供了新方向，有望进一步提高NSCLC脑转移患者的ICIs治疗效果。

同时，该研究也存在一定局限性，如scRNA-seq分析的样本量有限，未来需通过更大规模的前瞻性研究进一步验证结论；此外，ICIs治疗过程中，T淋巴细胞在脑组织、脑脊液和外周免疫系统之间的迁移规律，以及CD4+PDCD1+CXCR6+ T细胞的具体调控机制，仍需进一步深入探究。未来研究可进一步完善ICIs应答预测体系，为NSCLC脑转移患者的精准免疫治疗提供更坚实的理论支撑和实践指导。

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