mIHC多重荧光免疫组化——TSA技术

mIHC全称为多重荧光免疫组化技术（Multiplex Immunohistochemistry），是在传统免疫组化（IHC）基础上迭代升级的高通量、高空间分辨率病理检测技术。该技术可在同一张组织切片样本上，同时检测多个蛋白标志物（Marker）的表达水平、定位分布及共表达关系，能够完整保留组织微环境的空间结构信息，精准解析细胞异质性、细胞间相互作用以及组织原位的蛋白表达特征，广泛应用于肿瘤免疫、靶向药物研发、疾病机制研究、临床病理诊断等领域。

一、mIHC技术简介

mIHC多重荧光免疫组化是针对传统IHC痛点研发的多重检测技术，核心突破是单张组织切片实现多蛋白同步检测，结合酪胺信号放大技术、多色荧光标记、光谱成像与拆分技术，实现了病理检测从“单维单一指标”到“多维全景分析”的升级。

区别于传统IHC的酶促显色，mIHC以特异性荧光基团为信号标记，通过循环染色、信号放大、光谱采集拆分的流程，可在同一样本上完成4-10种甚至更多蛋白标志物的同步检测。该技术完整保留组织原位空间结构，可精准定位每个蛋白在细胞内的表达位置，同时量化蛋白表达强度、阳性细胞比例，还能分析不同细胞的空间分布、相互作用及共表达特征。

相较于传统技术，mIHC具备样本利用率高、检测通量高、空间分辨率强、定量精准、结果重复性好的核心优势，完美适配肿瘤免疫微环境分析、 biomarker筛选、药物作用机制研究、临床预后评估等高端科研与临床应用场景。

二、TSA技术原理

TSA（Tyramide Signal Amplification）即酪胺信号放大技术，是mIHC实现高灵敏度、多指标共染的核心底层技术，彻底解决了传统IHC信号弱、无法多重染色的技术瓶颈，其核心原理是基于酶催化的原位共价结合反应。实验过程中首先利用特异性一抗与组织切片中的目标蛋白抗原精准靶向结合，形成抗原-一抗复合物，以此保障检测的特异性，随后加入带有辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，让二抗特异性结合一抗，从而在目标抗原位点处锚定HRP酶分子，在此基础上加入带有荧光标记的酪胺底物，在HRP酶与体系内过氧化氢的共同作用下，酪胺底物被激活并转化为高活性的自由基中间体，活化后的荧光酪胺自由基极不稳定，能够快速与抗原位点周围组织蛋白中的酪氨酸残基发生不可逆共价结合，使大量荧光酪胺分子在目标位点原位聚集、沉积，最终实现检测信号的指数级放大。在完成第一个蛋白指标的信号沉积后，可使用温和试剂洗脱样本中的一抗、二抗复合物，只保留与组织稳定共价结合的荧光信号，之后更换不同荧光标记的酪胺底物，重复上述结合、催化、信号放大的实验流程，即可在同一张切片上依次完成多个不同蛋白标志物的染色检测，实现多指标循环检测。

三、TSA-mIHC标准实验流程

 1、 组织切片脱蜡与水化

 2、 抗原修复

 3、 阻断内源性酶

 4、 封闭

 5、 一抗与HRP二抗孵育

 6、 TSA荧光沉积

 7、 热修复剥离抗体

 8、 多轮循环染色

 9、DAPI染核与封片

 10、多光谱扫描与图像分析

四、TSA如何实现高灵敏度、多Marker共染

传统IHC仅依靠抗原-抗体结合的单一信号输出，信号强度有限，而TSA技术通过酶催化的原位信号富集放大，实现灵敏度百倍提升，核心原因有两点：

一是信号指数级放大：单个HRP酶分子可持续催化数十至上百个荧光酪胺分子原位沉积，相较于传统IHC一对一的信号结合模式，信号强度呈指数级提升，能够轻松捕捉组织中低丰度、微量表达的蛋白标志物，大幅降低假阴性率。

二是信号稳定性极强：酪胺分子与组织蛋白的结合为不可逆共价结合，结合产物稳定性极高，不会在后续洗脱、清洗、孵育流程中脱落，最大程度保留了目标信号，避免信号损耗，进一步提升检测灵敏度与准确性。

传统多重染色因抗体残留、信号干扰无法实现多指标同步检测，而TSA技术通过可控的循环染色体系，完美解决多指标共染的技术难题：

第一，可洗脱抗体体系，无交叉干扰。TSA染色中，仅荧光酪胺与组织发生共价结合，一抗、二抗均为非共价结合。每完成一个Marker的染色与信号固定后，可通过专用洗脱液彻底去除本轮的一抗、二抗，无抗体残留、无信号交叉干扰，为下一个Marker的染色提供纯净的反应环境。

第二，多色荧光光谱区分。搭配不同发射波长的特异性荧光基团标记酪胺底物，结合光谱成像系统的精准拆分技术，可有效区分多个荧光信号，避免光谱重叠干扰，实现同一张切片上多个Marker的独立识别与定量分析。

第三，循环迭代无样本损耗。整个染色过程无需重复切片，仅通过多次循环孵育、洗脱、信号沉积完成多指标检测，样本零损耗，同时保证所有Marker的检测结果对应同一组织视野，精准实现蛋白共定位、细胞互作分析。

EnkiLife TSA多重荧光服务推荐

为什么选择 Enkilife TSA技术服务？

      ? 专业mIHC/TSA实验平台

      ? 支持3-7色高通量检测

      ? 丰富肿瘤免疫项目经验

      ? FFPE样本优化方案成熟

      ? 提供抗体Panel设计与数据分析服务

 Enkilife服务内容

如果您正在开展肿瘤免疫微环境、空间生物学或多Marker共定位研究，欢迎咨询 EnkiLife TSA多重荧光免疫组化技术服务，我们可提供从Panel设计、实验检测到数据分析的一站式解决方案。