CRISPR-Cas9基因编辑技术的应用

1、基因敲除（Knock-out）

CRISPR - Cas9 系统中的 Cas9 蛋白是一种核酸内切酶，它在向导 RNA（gRNA）的引导下，能够识别并结合到目标基因的特定 DNA 序列上。Cas9 蛋白会在目标 DNA 序列上产生双链断裂（DSB）。在通常情况下，细胞会优先采用非同源末端连接方式（NHEJ）对断裂的DNA进行修复。但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失，造成移码突变，使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。为了提高CRISPR系统的特异性，可将Cas9的一个结构域进行突变，形成只能对DNA单链进行切割造成DNA缺口的Cas9-nickase核酸酶。因此想要形成双链断裂的效果可以设计两条sgRNA序列，分别靶向DNA互补的两条链，这样两条sgRNA特异性的结合靶标序列，即可形成DNA断裂，并在修复过程中通过移码突变实现基因敲除。

应用场景

①用于研究基因功能：以研究肿瘤相关基因为例，可以通过 CRISPR - Cas9 敲除某个疑似致癌基因，观察细胞表型变化，如细胞增殖、凋亡、迁移等能力的改变，从而确定该基因在肿瘤发生发展中的作用。

②构建疾病模型：以神经退行性疾病为例，可以在动物模型（如小鼠）中导入或敲入突变的与疾病相关的基因，如阿尔茨海默病相关的 突变型 APP 基因，模拟疾病的发生过程。

2、基因敲入（Knock-in）

当DNA双链断裂后，如果有DNA修复模板进入到细胞中，基因组断裂部分会依据修复模板进行同源重组修复（HDR），从而实现基因敲入。修复模板由需要导入的目标基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）组成，同源臂的长度和位置由编辑序列的大小决定。DNA修复模板可以是线性双链DNA、单链寡核苷酸（ssODN），也可以是质粒DNA。HDR修复模式在细胞中发生率较低，通常小于10%。为了增加基因敲入的成功率，目前有很多科学家致力于提高HDR效率，将编辑的细胞同步至HDR最活跃的细胞分裂时期，促进修复方式以HDR进行；或者利用化学方法 抑制 NHEJ 通路，提高HDR的效率。

应用场景

 ①基因治疗：对于一些单基因遗传病，如镰状细胞贫血，其病因是 β - 珠蛋白基因发生突变。可以利用 CRISPR - Cas9 将正常的 β - 珠蛋白基因敲入患者自身造血干细胞的基因组中，使这些干细胞能够产生正常的血红蛋白，从而治疗疾病。
②构建基因表达模型：可以将带有特定标签（如荧光蛋白基因）的序列敲入目标基因的特定位置，通过观察荧光信号来研究目标基因的表达模式和定位。

3、基因抑制、基因激活

Cas9的特点是能够自主结合和切割目的基因，通过点突变的方式使Cas9的两个结构域RuvC和HNH失去活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介导下结合靶基因，而不具备剪切DNA的功能。因此，将dCas9结合到基因的转录起始位点，可以阻断转录的开始，从而抑制基因表达；将dCas9与转录抑制因子或激活因子融合，靶向基因的启动子区域，可使下游靶基因转录受到抑制或激活。因此dCas9与Cas9、Cas9-nickase的不同之处在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不会对基因组DNA造成永久性的改变。

应用场景

①研究基因调控网络：在细胞分化过程中，许多基因的表达受到严格调控。通过激活或抑制某些关键基因，可以研究它们对下游基因表达和细胞分化方向的影响。

②药物靶点筛选：对于一些疾病相关基因，可以通过激活或抑制这些基因来观察细胞表型变化，筛选可能的药物靶点。