没有CRISPR之前，我们怎么编辑基因？——巨核酸酶（Meganuclease）

基因编辑技术的发展经历了从天然核酸酶改造 → 人工设计DNA识别结构 → 精准靶向基因组编辑的过程。在CRISPR/Cas9成为主流之前，Meganucleases（大范围核酸内切酶）、锌指核酸酶（Zinc Finger Nucleases, ZFNs）以及转录激活子样效应子核酸内切酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases, TALENs）曾是基因组精准改造领域的核心工具。

巨核酸酶（Meganuclease）

巨核酸酶又称大范围核酸酶、归巢内切酶（Homing Endonuclease），是第一代位点特异性基因编辑工具，依靠蛋白直接识别长 DNA 序列、精准切割双链 DNA，是 CRISPR 普及前最早用于真核基因组定点修饰的分子剪刀。

图1.巨核酸酶结合DNA结构示意图

技术原理

1. DNA 识别机制（间接读取 Indirect Readout）：酶蛋白β折叠插入DNA大沟，氨基酸侧链与碱基、DNA 骨架形成氢键或者范德华力；蛋白会弯折 DNA，其对DNA靶位点的识别与切割序列较长，一般为12-45bp，只有完全匹配序列才能稳定结合，单碱基错配会大幅丧失切割活性，脱靶极低PMC。

2. 切割模式：切割后产生3’黏性末端（4 bp 突出），便于同源重组修复；无需额外二聚化（区别 ZFN/TALEN），单蛋白即可完成结合 + 切割，载体构建更简单。

3. 基因编辑通路 DSB 触发两种细胞修复：

① NHEJ：随机插入缺失，实现基因敲除 KO；

② HDR：提供同源供体模板，实现定点敲入、基因修正、外源基因精准整合。

巨核酸酶的使用优势与限制：①MegN拥有较长的识别位点，对靶DNA具备高度特异性；②目前，天然大范围核酸酶的天然库仅包含约300种蛋白质，其中大多数仍为假设性的或未经过表征。这意味着它能够识别的靶位点相对较少，从而限制了其适用范围。

受制于天然巨核酸酶靶点稀缺的短板，早期依托该工具开展基因编辑细胞模型构建存在较大局限性。如今依托成熟多元的基因编辑技术体系，可高效完成各类细胞基因改造需求。EnCyto 细胞培养及检测平台拥有细胞系库 (800+)、原代细胞库 (1200+)、基础培养基和完全培养基 (2300+)，同时为客户提供过表达 (包括 CRISPRa 激活)、基因敲除 (KO 系列)、敲低 (shRNA、CRISPRi)、定点敲入 (KI) 稳转细胞系定制服务，全方位覆盖各类基因编辑细胞模型构建需求，高效助力科研人员开展基础研究。

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图片来源：Maeder ML, Gersbach CA. Genome-editing Technologies for Gene and Cell Therapy. Mol Ther. 2016 Mar;24(3):430-46. doi: 10.1038/mt.2016.10. Epub 2016 Jan 12. PMID: 26755333; PMCID: PMC4786923.