没有CRISPR之前，我们怎么编辑基因？——转录激活子样效应子核酸内切酶TALEN

基因编辑技术的发展经历了从天然核酸酶改造 → 人工设计DNA识别结构 → 精准靶向基因组编辑的过程。在CRISPR/Cas9成为主流之前，Meganucleases（大范围核酸内切酶）、锌指核酸酶（Zinc Finger Nucleases, ZFNs）以及转录激活子样效应子核酸内切酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases, TALENs）曾是基因组精准改造领域的核心工具。

一、转录激活子样效应子核酸内切酶（TALEN）：第二代模块化基因编辑工具 Tool

TALEN（Transcription Activator-Like Effector Nuclease，转录激活因子样效应子核酸酶） 是继ZFN之后的第二代人工基因编辑技术。其核心原理是将源自植物病原菌黄单胞菌的TALE蛋白（能特异性识别DNA序列）与FokI核酸酶（负责切割DNA）融合，从而在基因组的特定位置实现精准的双链断裂，进而诱导细胞进行基因敲除、敲入或修复。相比ZFN，TALEN在序列设计和靶向特异性上更具优势，更易操作。

图1. TALEN结构示意图

技术原理

1. DNA识别模块：TALE蛋白与RVD编码

TALENs的DNA识别功能依赖源自Xanthomonas的TALE蛋白。其DNA结合域由多个33–35氨基酸的串联重复单元构成，每个单元通过第12、13位重复可变双残基（RVD）以"一对一"方式识别单个碱基（如HD-C、NH-G、NI-A、NG-T），实现对任意靶序列的模块化编程识别。

2. DNA切割模块：FokI核酸酶

TALENs由TALE识别域与FokI核酸酶催化域融合而成。FokI无自主序列识别能力，其核酸酶活性严格依赖二聚体化——单个单体无活性，须成对TALEN分别结合靶DNA上下游序列后，两端FokI结构域空间邻近形成二聚体，方可在间隔区（12–25 bp）激活切割。

3. DSB诱导与细胞修复编辑

成对TALENs分别结合靶DNA上下游特异性序列后，两端的FokI催化结构域在间隔区相互靠近并发生二聚体化，激活其核酸内切酶活性，于靶点间隔区产生DNA双链断裂（DSB），切割位点通常形成3 nt的5'突出末端。随后，细胞通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）机制修复断裂，诱发位点特异性重组，实现基因敲除 ，敲入或修复。

TALE技术的使用限制与优势：①TALE的重复序列致使其难以通过聚合酶链式反应（PCR）进行构建；②TALEN无法靶向甲基化的DNA，因为胞嘧啶的甲基化可能会潜在地消除TALE的结合并改变其正常RVD的识别[13]；③与MN和ZFN相比，TALEN展现出高效率、低脱靶效应的特点。尽管如此，仍存在一些限制因素阻碍了TALE技术的更广泛应用。

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图片来源：Maeder ML, Gersbach CA. Genome-editing Technologies for Gene and Cell Therapy. Mol Ther. 2016 Mar;24(3):430-46. doi: 10.1038/mt.2016.10. Epub 2016 Jan 12. PMID: 26755333; PMCID: PMC4786923.