细胞形态异常自救指南

细胞培养过程中，状态良好的细胞通常具备特征性形态。但实验中常会观察到细胞形态发生突发性改变：原本形态规整的细胞出现胞体拉长，生成伪足、触角样突起，或是细胞异常成团聚集，胞质内大量空泡生成。细胞形态异常是细胞培养中最常见的“报警信号”，通常反映了细胞所处的环境、操作过程或自身状态出现了问题。本篇推文为你系统梳理了细胞形态改变的常见原因及应对策略。

1. 细胞老化与代次过高

l 原因：当传代次数过多或培养条件不佳时，细胞可通过以下两种机制进入不可逆的衰老状态：

① 复制性衰老（Replicative Senescence）：端粒因持续复制而耗尽，触发细胞周期阻滞；

② 应激诱导的早熟性衰老（Stress-Induced Premature Senescence, SIPS）：不良培养环境（如高氧、氧化剂积累、代谢废物堆积、营养失衡等）诱发氧化应激，活性氧（ROS）损伤DNA、蛋白质及脂质，进而通过p53/p21与p16/Rb信号通路导致细胞不可逆地停滞于G1期。

l 形态表现：细胞体积明显增大、扁平化的同时透光性变高，胞质内颗粒物增多，常伴随明显的空泡化，增殖速率下降（如图1）。

l 应对策略：严格记录细胞传代次数，若确认细胞代次已明显偏高，应立即停止使用，切勿将其用于机制研究或药物筛选等关键实验。及时丢弃衰老细胞，并从液氮中复苏早期低代次的细胞株，以确保实验结果的可靠性。

图1 A使用DFO和H?O?诱导Chang 细胞早熟性衰老；B通过对取自一名 5 岁男孩包皮的人类成纤维细胞进行连续传代，诱导产生复制性衰老^[1]

2. 生物性污染

l 原因：外源微生物污染（细菌/真菌/支原体等）可通过分泌毒素或竞争营养等，导致细胞形态改变。

l 形态表现：细胞增殖缓慢或形态上的改变（多角、多核等）胞质中产生空泡，细胞膜溃烂，细胞漂浮死亡（如图2是支原体污染导致 BV2细胞的胞体回缩、形态怪异、增殖变慢）。

解决办法：及时排查并消除污染源。针对轻度污染细胞，可以使用相应的清除试剂、抗生素等处理；针对污染严重的细胞，立即弃掉培养物，并对培养间进行全面消杀。防大于治，应加强无菌操作。

图2 BV2N：正常细胞；BV2MC：支原体污染 BV2；BV2-N＋LPS：LPS 刺激组；BV2MR：支原体药物清除后，细胞恢复正常形态^[2]

3. 细胞密度失衡

l 原因：细胞增殖是动态过程，不同密度下细胞状态略有差异。通常，细胞低密度时展得较开，高密度时细胞形态较规则（如图3）。但若细胞密度超出适宜范围，可能引发接触抑制等反应，致使细胞形态改变。

l 解决办法：在培养过程中合理控制细胞密度，若因密度过高导致细胞形态异常时，一般及时传代后可恢复其正常形态。同时避免在细胞密度过大时才进行传代，定期传代有利于维持细胞正常状态。

图3.不同密度的WS1（图片来自ATCC）

4. 血清批次敏感性应激

l 原因：不同品牌或批次的胎牛血清在生长因子、激素或内毒素含量上存在差异。某些细胞对血清较为敏感，更换其他品牌或是其他批次的血清时，如果细胞没有进行适应性过渡，就容易出现不适应的情况，进而引发细胞形态改变（如图4）。

l 解决方法：建议采用梯度替换方法，逐步过渡，以减少对细胞的影响。具体操作如下：首先用25%新血清与75%原血清进行混合，培养传代1-2次；然后用50%新血清与50%原血清混合培养；接着用75%新血清与25%原血清混合培养；最后完全使用新血清培养。

图4 KGN细胞在不同品牌血清的培养下的不同形态（图片来自于https://www.xiaohongshu.com/explore/69816d8a000000000b012a46?xsec_token=ABF9dSm8KR7H0PzWxWXe0U7Goy8NpPo30VzPwSPeuBkMI=&xsec_source=pc_search&source=web_explore_feedd）

5. 培养基适配性与主要营养成分缺失

l 原因：某些细胞只适合一种培养基，对培养基的某种条件（pH，渗透压，葡萄糖含量等）要求较高，更换培养基配方时，可能会导致细胞状态改变。培养基中缺少某些生长因子（如胰岛素）或添加物，可能无法满足细胞特殊营养需求，也会影响细胞的正常形态和生长（如图5）。

l 解决办法：严格参照该细胞的官方培养体系进行培养，按照推荐剂量添加特定成分，若非必要，不轻易更换培养基类型。若有细胞的专用培养基，建议优先使用。

图5 有谷氨酰胺DMEM培养基与无谷氨酰胺DMEM培养基培养MDA-MB-231细胞的不同形态^[3]

6. 药物干预与一般应激反应

l 原因：实验中加入的某些药物化合物可能会触发细胞的应激通路如氧化应激或DNA损伤反应，进而引起细胞骨架重排、代谢改变，直观表现就是形态骤变（如图6）。

l 解决办法：在进行正式药物处理前，可以用 CCK-8 或 MTT 等方法进行细胞毒性评估。若给药后观察到明显的形态改变，需结合细胞损伤程度和细胞活力，重新优化给药浓度与作用时间。

图6 经wortmannin处理并培养 24 小时的 MCF-7 细胞的相差显微照片^[4]

7. 细胞辅助试剂使用不当或者实验操作不当

原因：在细胞培养过程中，细胞辅助试剂使用错误（如冻存液配方不合理、胰酶消化试剂误用），或操作不当如消化不当、吹打过多、吹打力度过大等，均可能导致细胞形态改变（如图7）。

解决办法：提高操作技能，规范细胞辅助试剂选型与使用，确保细胞培养过程中的每一步都符合细胞培养规范，从而避免因试剂或操作问题导致细胞形态改变。

图7采用不正确的冻存液冻存猪主动脉内皮细胞导致细胞形态发生改变^[5]

参考文献

[1] Hwang ES, Yoon G, Kang HT. A comparative analysis of the cell biology of senescence and aging. Cell Mol Life Sci. 2009;66(15):2503-2524. doi:10.1007/s00018-009-0034-2

[2] Feng N, Huang X, Jia Y. Mycoplasma contamination affects cell characteristics and decreases the sensitivity of BV2 microglia to LPS stimulation. Cytotechnology. 2019;71(2):623-634. doi:10.1007/s10616-019-00311-8

[3] Gwangwa MV, Joubert AM, Visagie MH. Effects of glutamine deprivation on oxidative stress and cell survival in breast cell lines. Biol Res. 2019;52(1):15. Published 2019 Mar 27. doi:10.1186/s40659-019-0224-9

[4] Akter R, Hossain MZ, Kleve MG, Gealt MA. Wortmannin induces MCF-7 breast cancer cell death via the apoptotic pathway, involving chromatin condensation, generation of reactive oxygen species, and membrane blebbing. Breast Cancer (Dove Med Press). 2012;4:103-113. Published 2012 Jul 13. doi:10.2147/BCTT.S31712

[5] Pless-Petig G, Knoop S, Rauen U. Serum- and albumin-free cryopreservation of endothelial monolayers with a new solution. Organogenesis. 2018;14(2):107-121. doi:10.1080/15476278.2018.1501136