CRISPR/Cas9系统做编码基因的敲除可以用qPCR来验证吗？

CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理是Cas9核酸酶在sgRNA的引导下，精确识别并切割目标基因位点的双链DNA。细胞通过非同源末端连接（NHEJ）机制修复DNA双链断裂。该修复过程具有随机性，容易在断裂位点引入碱基的插入（Insertion）或缺失（Deletion），即Indel突变。若Indel突变导致阅读框移位（frameshift），通常会引入提前终止密码子（PTC），使翻译提前终止，最终导致蛋白功能丧失。

核心要点：CRISPR/Cas9首先改变的是DNA序列层面，而非直接降低mRNA的转录水平。因此，仅通过qPCR检测目的基因的mRNA表达量，不足以充分验证敲除效果。mRNA水平可能变化不大，但蛋白功能已完全丧失。

为什么qPCR为何有时能检测到mRNA下降？

当移码突变产生提前终止密码子（PTC）后，细胞可能启动一种RNA质量控制机制——无义介导的mRNA降解（Nonsense-mediated mRNA decay，NMD）。

DNA发生移码突变，转录形成异常mRNA。mRNA携带提前终止密码子（PTC），NMD识别异常mRNA，异常mRNA被快速降解，最终qPCR检测到mRNA下降。

关键结论：mRNA下降只是NMD发生后的间接结果，而不是CRISPR敲除本身造成的必然结果。

若NMD效率不足或PTC位置不符合NMD识别条件（如位于mRNA最后50至55个核苷酸内），mRNA水平可能无明显变化。因此，qPCR检测mRNA下降既不是敲除成功的充分条件，也不是必要条件。即使mRNA水平不变，蛋白功能也可能已完全丧失。反之，mRNA下降也不能直接证明移码突变的发生。

NMD的核心识别机制

NMD并非直接识别PTC本身，而是通过以下分子逻辑判断终止密码子是否异常。

外显子-外显子连接复合体（Exon Junction Complex，EJC）在mRNA剪接过程中被沉积于外显子-外显子连接点上游约20至24个核苷酸处。

50至55核苷酸规则：正常情况下，翻译终止发生在最后一个EJC的下游，核糖体在终止时会将EJC移除。若PTC位于最后一个EJC上游超过50至55个核苷酸的位置，终止时EJC未被移除，EJC与终止释放因子（如UPF1、UPF2、UPF3）相互作用，触发NMD。

核心因子UPF1是NMD的关键效应因子。UPF1被磷酸化后招募核酸外切酶，导致mRNA快速降解。

无义介导的mRNA降解

PTC位置对NMD效率的决定性影响，PTC位置不同，NMD效率及结果也不同。

若PTC位于最后一个外显子或距末端EJC小于50至55个核苷酸，NMD效率低效或逃逸，mRNA水平可能无明显变化。

若PTC位于中间外显子，距EJC大于50至55个核苷酸，NMD效率高效，mRNA显著下降，qPCR可检出。

若PTC靠近5'端（早期外显子），通常NMD高效，mRNA大幅下降。

若PTC靠近3'端（最后外显子），通常NMD低效，mRNA可能维持正常水平。

此外，NMD效率存在细胞类型差异。某些细胞系（如HeLa、U2OS）NMD活性较强，而另一些细胞（如部分神经元、干细胞）NMD较弱或存在替代剪接逃逸机制。

为什么很多KO细胞mRNA没有下降？

这是实验中最容易误解的一点。实际上，大量CRISPR KO细胞会出现以下现象：mRNA几乎没有变化，qPCR结果仍接近野生型（WT），但蛋白已完全消失。

原因一：未触发NMD

并非所有提前终止密码子（PTC）都会激活无义介导的mRNA降解（NMD）。以下情况异常mRNA仍可稳定存在。

PTC距离最后一个外显子过近，位于最后50至55个核苷酸内，NMD无法识别。

PTC位于最后一个外显子，缺乏下游EJC，NMD逃逸。

PTC靠近最后一个外显子连接位点，EJC在翻译终止前已被核糖体移除。

原因二：非移码突变（In-frame mutation）

CRISPR产生的Indel不一定导致移码。

例如，删除3 bp，缺失1个氨基酸，阅读框完整。删除6 bp，缺失2个氨基酸，阅读框完整。删除9 bp，缺失3个氨基酸，阅读框完整。

结果：mRNA正常，qPCR正常，蛋白仍可能表达，仅缺失少数氨基酸。

这种情况不能称为真正的基因敲除（KO），蛋白功能可能部分保留。

CRISPR/Cas9系统做编码基因的敲除如何验证呢？

Sanger测序验证

Western Blot蛋白表达验证

流式 功能验证

CRISPR/Cas9系统做编码基因的敲除做这三个层面的验证就够啦。

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参考文献

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