双抗体夹心法 ELISA 常见FAQs

Q1：双抗体夹心法 ELISA 需要哪些核心试剂？

A：核心试剂包括 ELISA 包被液、洗涤缓冲液、封闭液（5% 脱脂奶粉或 1% BSA）、捕获抗体、检测一抗、酶标二抗、TMB 显色液、终止液。实验前需按照说明书将浓缩母液稀释为 1× 工作液使用。

Q2：实验前可以直接放在 37℃快速解冻试剂吗？

A：不可以。所有试剂需要提前平衡至室温，禁止直接置于 37℃条件下解冻溶解。试剂与样本稀释过程中充分混匀，尽量避免产生气泡，防止影响加样与反应结果。

Q3：使用商品化 ELISA 试剂盒，还需要做抗体包被和封闭步骤吗？

A：绝大多数商品化 ELISA 试剂盒的酶标板已经预包被捕获抗体，此种情况下无需进行包被、洗板以及封闭操作。实验前务必仔细阅读试剂盒说明书确认，避免多余操作。

Q4：捕获抗体可以用什么缓冲液包被？有哪些孵育方案？

A：捕获抗体可选用碳酸盐缓冲液或者磷酸盐缓冲液稀释，每孔加入100?μL稀释后的抗体。可选两种孵育方案：37℃孵育2小时，或者4℃过夜孵育。

Q5：如何正确完成洗板操作？

A：洗涤缓冲液使用 10?mM PBST（10?mM PBS + 0.05% Tween20）。每孔加入 200?300?μL 洗涤工作液，浸泡 1?2 分钟，弃去液体后将板子在吸水纸上轻轻拍干，去除孔内残留液体。每轮洗涤3?5次。

Q6：加样有哪些注意要求？

A：每次实验应设置空白孔、标准品孔、样本孔。空白孔加入100?μL样本稀释液；其余孔加入100?μL标准品或待测样本。避免产生气泡，加样时加到孔底，不要触碰孔壁。一块板子尽量在3分钟内完成全部加样。盖上板盖或者封板膜，37℃孵育。每一次独立实验都要配制新鲜标准品，保证数据可靠性。

Q7：检测抗体与酶标二抗的孵育条件是什么？

A：按照实验要求，使用抗体稀释液稀释检测抗体、二抗，每孔加 100?μL，分别 37℃孵育 1 小时，每步孵育结束后洗板3?5次。

Q8：如何控制 TMB 显色与终止反应？

A：每孔加入 100?μL TMB 底物液，37℃避光孵育15分钟。可根据实际显色情况调整孵育时间，但是要防止显色过度。当标准品孔出现明显颜色梯度时，每孔加入50?μL终止液，溶液会由蓝色变为黄色。

Q9：什么时候读 OD 值？如何读取？

A：尽量在加入终止液后 5 分钟内完成检测。设置 630?nm 作为参比波长，使用酶标仪读取各孔 450?nm 处吸光度（OD 值）。

Q10：原始 OD 数据该如何处理？

A：将标准品和样本的 OD 读数减去空白孔 OD 值。如果设置技术复孔，计算每组复孔的平均 OD 值。

Q11：如何根据标准曲线计算样本浓度？

A：以标准品浓度为 X 轴，处理后的 OD 值为 Y 轴，使用 Origin、ELISACalc 等专业软件进行拟合。从标准曲线得到样本 OD 对应的拟合浓度，再乘以样本稀释倍数，得到样本最终检测浓度。

Q12：背景信号高，所有孔均出现明显蓝黄色显色

A：可能原因：洗板不充分、封闭不完全、抗体浓度过高、试剂污染。可延长洗板浸泡时间；确认封闭液浓度，延长封闭时间；重新优化抗体稀释比例；更换污染试剂，加样使用全新枪头。

Q13：标准品和样本均显色微弱或者完全不显色

A：检查试剂是否过期失活；核对每一步孵育温度与时间；避免洗板过度，洗板过度会洗脱掉结合的复合物；确认没有遗漏关键实验步骤；试剂务必提前平衡至室温；核对酶标仪波长设置是否正确。

Q14：复孔间 CV 值偏大，实验重复性差

A：加样产生气泡、加样体积不一致、洗板拍板后孔内残留液体、孵育温度不均均是主要诱因。加样尽量避免气泡；校准移液枪；每轮洗板后充分拍干残留液体；孵育时使用封板膜密封，保证整板温度均一。

Q15：标准曲线拟合效果差

A：每次实验配制新鲜标准品；严格按照稀释操作，避免标准品母液反复冻融；单块板加样尽量控制在3分钟以内；保证孵育温度稳定；曲线建议采用四参数逻辑拟合，不要简单使用线性拟合。

Q16：酶标板外围孔出现边缘效应

A：主要由液体蒸发导致。孵育使用全新封板膜；孵育箱内不要堆叠多块 ELISA 板；维持孵育箱内部温度稳定；尽量缩短整板加样耗时。