无一抗种属限制的TSA多重免疫荧光染色技术

在肿瘤微环境研究、空间生物学及精准病理诊断快速发展的今天，多重免疫荧光（Multiplex Immunofluorescence, mIHC）已成为组织样本分析的重要工具。相比传统免疫组化（IHC）和普通免疫荧光（IF），mIHC能够在同一张组织切片上同时检测多个蛋白标志物，实现细胞表型识别、空间定位分析以及细胞间相互作用研究。

然而，在实际实验中，许多科研人员都会遇到一个共同难题：多个目标蛋白的一抗来自同一种属，无法进行常规多重染色。TSA（Tyramide Signal Amplification，酪胺信号放大）技术的出现，为这一问题提供了理想解决方案。其中，无一抗种属限制的TSA多重免疫荧光染色技术更是成为当前空间病理研究领域的重要技术路线。

在常规免疫荧光实验中，不同目标蛋白通常需要使用不同种属来源的一抗，例如：

? 小鼠抗CD8

? 兔抗PD-L1

? 山羊抗FOXP3

随后利用对应种属的荧光二抗进行检测。

这种方式存在明显限制：

? 可选择的一抗组合有限

? 热门靶点抗体往往集中来源于兔或鼠

? 当多个目标均为兔源抗体时无法区分信号

? 多重标记数量受到严重限制

假如研究者需要检测CD3，CD8，PD-1，PD-L1四种靶标，但手上的一抗都是兔源的，采用传统IF方法几乎无法完成同时检测。

TSA技术的核心原理是：利用HRP（辣根过氧化物酶）催化荧光酪胺分子，在抗原周围形成不可逆共价沉积。

基本流程：抗原识别→ 一抗结合→ HRP标记二抗结合→ TSA荧光沉积→ 抗体剥离→ 下一轮染色

由于荧光信号已经牢固沉积在组织中，即使后续通过热修复或抗体洗脱步骤将前一轮抗体完全去除，荧光信号仍然保留。因此，下一轮检测时，可以再次使用相同种属来源的一抗，而不会产生交叉反应。

1. 抗体选择更加自由

研究人员无需为了避免种属冲突而更换抗体。可以直接选择文献验证充分的抗体、效果最佳的抗体或者已建立数据库的抗体，可以显著降低实验开发难度。

2. 实现更高重数检测

传统IF通常只能完成1-2色检测。TSA技术可实现3-7，甚至更多重检测。满足复杂肿瘤微环境研究需求。

3. 显著提高检测灵敏度

TSA属于酶促信号放大技术，相比普通荧光标记，信号强度可提升10~100倍。对于低表达蛋白、稀有细胞群和微量生物标志物具有明显优势。

4. 广泛适配性与场景兼容性

样本类型上，可适配石蜡切片、冷冻切片、细胞爬片、细胞涂片、组织芯片、类器官等多种生物样本。检测模式上，可与荧光显微镜、共聚焦显微镜等常用设备兼容，无需额外购置专用仪器。

5. 温和操作保护样本

TSA试剂盒配套的抗体洗脱剂采用温和配方，无需依赖高温微波处理，即可在去除未结合抗体的同时，完整保留靶点抗原与已标记的荧光信号。这种温和洗脱方式使得每一轮循环染色后组织形态仍能保持完整，大幅降低了样本损伤风险。对于珍贵样本而言，TSA 技术的这一优势尤为重要。

1. 科研领域：

- 神经科学：检测神经元稀疏表达的突触蛋白或神经递质。

- 癌症：定位肿瘤微环境中的稀有生物标志物（如PD-L1）。

- 发育生物学：观察胚胎组织中的低丰度信号分子。

- 空间生物学：解析肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞之间的空间关系。

- 其他

2. 临床诊断：

- 增强病理切片中弱表达抗原的检出率（如HER2/neu在乳腺癌中的表达）。

- 用于循环肿瘤细胞（CTCs）或微小残留病灶（MRD）的检测。

3. 特殊样本：

- 适用于穿刺活检、骨组织、脑组织、类器官、稀有细胞及长期保存FFPE等特殊样本，实现有限样本中多靶标、高质量的空间表达分析。

   大鼠肾（10×）

   

大鼠脑（5×）

虽然TSA技术能够突破种属限制，但实验设计仍需注意：

? 抗原修复条件优化

? 抗体染色顺序设计

? TSA荧光通道搭配

? 光谱重叠控制

? 抗体剥离效率验证

? 多光谱成像与光谱拆分分析

合理的Panel设计往往决定最终实验成功率。

随着空间组学和数字病理技术的发展，多重免疫荧光已经成为揭示组织微环境的重要工具。TSA信号放大技术通过“荧光沉积+抗体剥离”的创新机制，彻底突破了传统免疫荧光对一抗种属来源的限制，使科研人员能够自由组合抗体、实现高重数检测，并获得更高灵敏度和更丰富的组织空间信息。

对于肿瘤免疫研究、空间生物学、药物研发及临床转化研究而言，无一抗种属限制的TSA多重免疫荧光技术正逐渐成为高质量空间病理分析的标准方案。选择成熟稳定的TSA多重免疫荧光试剂体系和专业技术支持平台，将有助于提高实验成功率，加速科研成果产出，为精准医学研究提供更强大的技术支撑。