WT 野生型峰图 vs CRISPR 编辑 Sanger 峰图如何看？

WT 野生型峰图 vs CRISPR 编辑 Sanger 峰图如何看？

WT：靶点上下游全程干净单峰；

CRISPR（NHEJ-Indel）：Cas9 切割位点之后开始出现套峰 / 双峰、峰形移位，切割位点上游仍然干净，这是最关键的识别特征。

颜色惯例：A 绿，T 红，C 蓝，G 黑（不同软件可自定义）

一、WT 野生型峰图

? 特征

从测序引物开始，所有碱基都是单一尖锐峰，无重叠杂峰，峰高均匀、基线干净。

碱基判读序列和参考基因组 100% 匹配，sgRNA 靶点、PAM 区域完全正常。

只有测序最前端（前 20–50 bp）和末尾会有正常噪声，靶点区域绝对干净。

原理：所有 DNA 分子序列一致，每个位置只释放一种荧光。

二、CRISPR 编辑峰图

原理：Cas9 在 sgRNA 靶序列内、PAM 上游约 3 bp 处切断双链；NHEJ 随机修复产生插入 / 缺失 Indel。不同长度的模板分子在切点之后碱基相位错开、叠加成套峰；切点上游序列不受影响，仍保持干净单峰。

1）细胞池（混合细胞，未挑单克隆，最常见初筛）

切点上游：干净单峰（同 WT）

到达 Cas9 切割位点后，立刻出现多层重叠套峰，一直延续到测序末尾

峰高下降、多色峰叠在同一个位置，软件自动输出的碱基序列会乱掉

解读：细胞群里一部分 WT、一部分 +1 / -1 / -2 等多种 Indel 混合

2）杂合突变（一条等位 WT，一条等位 Indel；单克隆）

切点上游：干净单峰

切点之后：双峰 / 套峰（2 套固定序列叠加：WT + 突变型）

与细胞池的区别：只有 2 套序列，每个位置最多 2 个峰，峰型相对规律；细胞池是多套 indel 叠加，更杂乱

TA 克隆可分开拿到 WT 和突变两条序列

注意：若 indel 长度为 3 的倍数，不会移码，蛋白可能仍有功能

3）双等位突变（两条染色体都带 indel，KO 单克隆）—— 分两种情况

a. 双等位相同 indel（纯合）

切点上游：干净单峰

切点之后：整套峰图整体平移，恢复单峰（但序列与 WT 不同）

不再是套峰！因为所有模板分子序列一致，只是相位整体偏移；直接比对参考序列即可看到固定的插入 / 缺失

?? 重点区分：套峰与否取决于"模板中有几种序列"，与是否是单克隆无关

双等位相同 indel → 单峰整体平移（最容易被误判为"测序失败"，实为移码成功）

两条等位只要序列不同（杂合、细胞池、双等位不同 indel）→ 套峰

b. 双等位不同 indel（compound heterozygous）

单克隆中两条染色体各带不同的 indel（如一条 -1、一条 -4）

切点后照样出现套峰，表现与第 2) 条杂合几乎一致，肉眼难以区分

也是有效 KO 单克隆，需 TA 克隆或拆峰软件确认两条等位的具体基因型

4）HDR 精准敲入 / 点突变（不是 NHEJ Indel）

双等位都带敲入：全程单峰，仅靶点位置 1~ 数个碱基改变，下游不偏移、不套峰

单等位敲入 + 另一等位 WT（杂合 HDR）：在被改变的碱基处出现局部双峰，但下游序列不偏移、不产生持续套峰 —— 这是 HDR 筛选的重要判读特征

HDR 不完全、混有 NHEJ 产物：切点后套峰

The editing results and data statistics of mutant plants. (a) Displays Sanger sequencing results at the target site in mutated somatic embryo plants. Blue indicates the target site and red denoting PAM sites. Nucleotide insertion, deletion, and substitution are marked as 'i', 'd', and 's', respectively. (b) Sequences at target site 1 in mutant somatic embryo plants. The black arrows indicate the mutation sites. PAM sites are highlighted in red spaces. (c) The results 1-1, 1-2 and 1-3 are single base mutations at the black arrows sites. The sequencing chromatograms of 1-2 and 1-3 are characterized by significantly double peaks. The result 1-4 is a single base insertion at the black arrow site. (d) The result 2-1 is single base mutations at the black arrows sites. The sequencing chromatograms of the 2-2 to 2-5 were characterized the deletion of bases at the black line. The result 2-5 is also showed single base mutations at the black arrows sites^[1].

这有一张CRISPR 基因编辑 Sanger 测序验证图，大家来一起练练手吧

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参考文献

[1] Ma M, Zhang C, Yu L, Yang J, Li C. CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein mediated DNA-free genome editing in larch. For Res (Fayettev). 2024 Oct 31;4:e036. doi: 10.48130/forres-0024-0033. PMID: 39552837; PMCID: PMC11564729.